美国药典微生物检测精要.

美国药典微生物检测精要 培训小结

一 微生物实验室规范

重要的控制点:无菌技术、培养基控制、菌种控制、设备操作与控制、数据记录与实验 室布局和运作、员工培训等。

1无菌技术:防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。 可通过无菌 环境、灭菌、消毒、卫生要求、无菌操作技术等手段来实现。

2培养基:是微生物实验工作的核心。包括培养基制备、培养基储存、培养基质量控制。 2.1培养基制备

2.1.1根据既定的目的选用正确的培养基

2.1.2参考生产商的COA和说明书:关于配制、储存和菌种选用等。 2.1.3所用的水应为去离子水或蒸馏水,应记录用量。

2.1.4成分的称量应用校准过的天平,根据称量量的不同选择合适的天平。使用清洁的容器 和工具(<1051>玻璃器皿清洁以防外来污染和抑制剂。应记录称量量。

2.1.5加热帮助溶解时应防止过度加热,通常培养基颜色变深说明加热过度了。 2.1.6灭菌条件:

●灭菌参数应验证,验证应同时考虑无菌和培养基生长能力

●采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。 湿热灭菌应考虑装载分布, 加热速度过慢会使培养 基过度加热,通常为 121℃ 15min ,此时间是指培养基温度达到 121℃后 15min 。 ●保证最低 SAL ,在无菌和过度加热之间平衡。

●与污染物分开灭菌

●消毒结束后, 不应在灭菌柜中储存培养基, 过度加热会影响培养基颜色、 澄清、 pH 和凝固能力。

2.2培养基储存 2.2.1制备培养基的储存

●琼脂培养基易受冷冻影响,低于 0℃会破坏凝胶结构。

●应避光避热,密封防止水分蒸发(建议使用螺旋盖的瓶子密封,保存时间长 。 2.2.2培养基融化

●不能超过一次,以防过度加热或潜在污染。

●融化可采用水浴、 流通蒸汽或微波炉加热。 微波炉加热宜采用少量多次, 以防过度。 ●培养基融化后在 40-50℃水浴中储存不应超过 8小时, 浇制平皿前应擦干以防污染。 2.2.3培养基标示

●培养基名称 ●批号、制备批号 ●制备日期、有效期 2.2.4有效期确定

●根据成分、配方、容器、储存条件等确定 ●有生长能力试验数据支持 2.2.5应在验证过的条件下储存 2.2.6重要区域环控用培养基必须 ●双层包装

●最终灭菌,否则进行全数培养及用前检查

2.2.7根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基 2.3培养基质控 2.3.1灭菌后培养基检查 2.3.1.1生长能力

●每批制备的培养基均需进行

●测试菌种根据药典,供应商说明书及环境中分离得到

●测试不合格应进行调查,如无原因,或无有效纠正措施,不得使用该批号 2.3.1.2无菌

2.3.1.3pH

2.3.1.4容器 /平皿的完整性 2.3.1.5抑制或指示能力

2.3.2定期稳定性检查以确认储存有效期 3菌种保藏

3.1建立标准程序处理、保存菌种,防止污染和特性变化 3.2使用前确认菌种身份和纯度

3.3根据生产商说明书复苏菌种,使用接种技术

3.4-70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种,可延长保存周期 3.5开启后不要重新冷冻菌种,剩余部分应弃置

3.6传代次数(每接种一次即为一代不超过 5次 3.7保藏时间根据具体保藏条件确定 4设备维护 4.1定期校准、保养 4.2定期性能检查 4.3定期清洁、消毒 5实验室布局和运作 5.1防止交叉污染

5.2活动分区:无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行 5.3当发现微生物生长,后续的工作应转移至“阳性”区 5.4环控设备应放置在待取样区域环境中并小心操作 5.5应在受控条件下小心取样 6样品处理

6.1大部分样品、水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感 6.2减少样品,取样与测试间的时间间隔

6.3长时间的转移需确认转移条件对测试及样品的影响 6.4在无菌条件下,使用无菌技术取样,即使是非无菌样品

6.5取样记录:样品信息、取样日期、送样日期、人员 /部门、实验室样品接受及确认

7培养基培养时间 7.1短于 3天,用小时表示

7.2长于 3天,用天表示(上午、下午,相同时间段 8人员培训

8.1每个岗位应有相应培训要求,进行上岗前资质确认 9实验室文件

9.1微生物人员培训和能力确认(上岗资质 9.2设备验证、校准和维护 9.3测试中的设备性能(如温度记录

9.4培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试 9.5培养基清单与控制

9.6根据程序(SOP进行测试的重要数据 9.7数据和计算的确认

9.8经QA人员或相应领导审核过的报告 9.9超标结果调查 10实验室结果维护 10.1检测报告至少应包括: ●日期 ●测试样品

●微生物检验人员名字 ●程序编号 ●测试结果 ●偏差(如有

●测试参数(设备、菌种、培养基 ●管理人员审核签名

10.2数据纠错:错误的地方划一横线,签名和日期,必要时说明原因 10.3测试结果

●应包含平皿计数结果(如有 ●数据分析方法应罗列在相关SOP中 ●对粘贴的图表、数据骑缝签名

10.4存档:记录应存档并防止丢失,应有记录留存计划 11测试结果解释

11.1微生物数据有时不容易解释

●与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试 ●人员污染是始终被关心的问题 ●样品或环境中的微生物并非均匀分布

●微生物检测可变范围大:可能在 +/-0.5log10单位左右

11.2不符合的结果可能是由 2个原因造成的:实验室错误或产品不符合。无论哪种情况,管 理层必须立即被通知

11.3调查应包括: ●数据偏离的程度(严重性 ●平行数据间差异的评估 ●实验室环境 ●取样方法

●物料特性(存活的污染微生物 ●人员面谈 ●留样评估 ●测试过程

11.4纠偏计划(警戒限、行动限 ●如果发现实验室错误,需要 ●纠偏措施的有效性需要跟踪和记录

11.5无效测试:由于错误将试验视作无效必须记录 11.6确认测试(复试 :应有SOP描述何时进行 二 非无菌产品:微生物计数 1 常规过程

1.1 避免产品以外的微生物的污染。

1.2去除细菌抑制 /真菌抑制性。

1.3证明表面活性剂的无毒性及其与抑制剂的相容性。 2 计数方法 2.1薄膜过滤法

2.2平皿计数法:平皿浇注法,表面涂布法。

2.3最大可能性数量法(MPN :用于检测极少数量的微生物,精密度、准确度差,不适合 用于霉菌。

3 生长能力测试和方法适用性 3.1 生长能力测试: ●一般考虑 ●测试菌株准备 ●缓冲液 ●阴性对照 ●培养基生长测试 3.2 计数方法适用性: ●样品制备 ●接种与稀释 ●中和 /去除抗菌活性

●产品存在情况下的微生物的回收率

●结果与解释

4 微生物数据的可变性 4.1 成品测试 4.1.1抗菌效力测试 4.1.2 微生物限度检查 4.2 培养基生长能力测试

固体培养基,计数结果与标准接种物的计数数量差别小于系数 2。对新鲜制备的菌液,生 长与前批已通过的培养基的前次测试结果一致。

4.3 计数方法适用性测试

样品计数结果与对照计数结果的相差小于系数 2。 4.4 微生物回收率验证 4.4.1 固体培养基的回收率验证 4.4.2 受损微生物的恢复

三 非无菌产品:控制菌微生物测试 1 常规过程

1.1 避免产品以外的微生物的污染。 1.2 去除细菌抑制 /真菌抑制性。 2 产品测试 2.1 样品制备和增殖

2.2 选择性培养 2.3 结果解释

3 培养基适用性测试和方法适用性测试 3.1 培养基适用性测试: ●测试菌株准备 ●菌株 ●阴性对照

●生长能力测试、抑制及选择性测试 3.2 方法适用性: ●样品制备 ●接种与稀释 ●中和 /去除抗菌活性

●产品存在的情况下,微生物的回收率 ●结果与解释 4 菌种

●金黄色葡萄球菌 ●铜绿假单胞菌 ●大肠埃希菌 ●肠道沙门氏菌

●白色念珠菌 ●梭菌

4.1 微生物使用不超过 5代

4.2 PH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液或 PH7.2磷酸盐缓冲液制备悬浮菌液 4.3 悬浮菌液 2小时内使用, 2-8℃不超过 24小时

4.4 生孢梭菌也可制备孢子悬浮液, 2-8℃保存期限需确认 四 药物制剂和药用物质的接受标准 1 非无菌制剂的微生物质量标准 1.1口服固体 1.2 口服液体 1.3 直肠制剂 1.4 局部及鼻腔制剂 1.5 阴道制剂 1.6 吸入剂

1.7 活性药物成分、辅料 2 药物产品的接受标准 2.1 其他重要性根据评估: ●产品用途 ●产品特点

●应用的方法

●药物接受者:对婴儿、幼儿及衰弱患者的风险是不同的 ●存在疾病、伤口、器官损伤

相应的因素的风险评估由经授权的有资质的人员进行 3 有害微生物

3.1 有害微生物的概念不适合无菌产品,无菌产品中不得有任何微生物 3.2 将用于非无菌产品的微生物测试, 及非无菌产品环境中分离到的微生物评估及清洁验证 3.3 有害微生物的定义:

3.1.1 能在产品中增殖的微生物,对药品的物理特性及治疗作用有负面影响 3.1.2 由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染 4 微生物质量相关的产品召回 5 USP微生物质量接受标准 5.1 USP各论要求是最低的公共标准 5.2 通则提供了符合各论要求的方法 5.3 有效期内测试

5.4 不等于成品所需的所有放行测试 五 水分活性确定对非无菌药品的应用 1 水分活性

1.1非无菌药物制剂中水分活性的确定:

1.1.1 改善产品处方以提高防腐系统的抗菌效力 1.1.2 降低可能在产品处方中化学水解的活性成分的降解 1.1.3 降低微生物对产品的污染

1.1.4 可以减少和如何筛选需测试的控制菌 1.2 降低水分活性在微生物生长方面的作用

1.2.1 较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的微生物数量 1.2.2 减少微生物毒素的产生

1.2.3 在某个微生物专有的水分活性以下,该微生物不会生长 1.2.4 水分活性下降后,微生物的耐热性会提高 2 测试策略

2.1水分活性高于 0.75的多剂量水性药品需要加入防腐剂并将微生物限度测试作为常规放 行测试

2.2 水分活性低于 0.75的药品不需额外防腐,在风险评估后不需要将微生物限度测试作为 常规放行测试

2.3 制药厂商对原料厂商的生产工艺、质量计划、 测试记录有全面的了解。 这些可以通过供 应商审计计划得到

六 无菌测试

1 灭菌和无菌保证中的观点:按照无菌最严格的定义,只有当样品中完全没有活的微生物 时,它才能被称为是无菌的。

2 无菌测试的首要难点:整批产品不能进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的。

2.1 无菌是根据概率的原则判断的。 从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判 断。

2.2 目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。

3 无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌 工艺或无菌工艺的验证来得到的。

4 无菌测试流程

4.1 培养基和细菌抑制 /真菌抑制性测试(方法验证 4.2 去除任何抑制细菌和真菌生长的因素 4.3确定用于测试的样品数量,每个样品的用量 4.4 培养样品

4.5 检查测试样品是否有生长的迹象

4.6 显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象 4.7 必要的话再接种培养 4.8 写报告 5 培养基测试 5.1 培养基的储存 ●2-25℃ ●无菌,密闭容器

●储存不超过验证过的期限

●硫乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合 5.2 培养基的无菌:

●每种要求的培养基取一部分在特定温度下培养 14天,检查是否浑浊 ●与测试同时进行培养基的无菌检查 5.3生长能力测试:

●在硫乙醇酸盐液体培养基中加入≦ 100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生 饱梭菌

●在大豆酪蛋白消化培养基中加入≦ 100cfu 的枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌 ●细菌 3天、真菌 5天

●检查生长的迹象 6 方法适用性测试

6.1 将待测样品内在的细菌抑制性和真菌抑制性去除

6.2 制备微生物培养的稀释液,最终浓度应使加入产品的微生物数量不超过 100cfu 6.3 根据产品(或各论要求使用膜过滤法或直接接种法

6.3.1 膜过滤法:

●产品特征允许的话,作为首选方法

●将测试样品滤过,将微生物截留在滤膜上(孔径不大于 0.45uM ●在最后一步冲洗液中在加入不超过 100cfu 的微生物 ●将滤膜放入测试用培养基

●记住对 6个微生物,每个都要这样操作(见上述生长能力测试 ●进行培养基生长能力测试作为阳性对照 ●在适宜温度下培养不超过 5天

6.3.1.1 冲洗:“每个滤器冲洗不要超过 100ml 5次,即使在验证中显示这样的冲洗还不能 完全去除抗菌活性

6.3.1.2 化学添加物 6.3.2 直接接种法:

●将样品加入培养基。样品体积不超过培养基体积的 10%。 (或配制浓缩培养基 ●培养基中加入不超过 100cfu 的微生物

●记住对 6个微生物,每个都要这样操作(见上述生长能力测试 ●进行培养基生长能力测试作为阳性对照 ●在适宜温度下培养不超过 5天 7 微生物回收率验证

7.1 当测试方法决定于微生物生长时,去除细菌抑制性或真菌抑制性是很重要的 7.2 可以使用特殊的中和剂、进行稀释或通过这些不同方法的组合 8 通常的注意点:

●无菌测试在无菌环境中进行

●注意避免污染的同时,注意不要影响测试对微生物的检出

●进行测试的工作环境应通过对工作环境取样进行定期监测,并进行适当控制 ●无菌测试时包括适当的阴性对照

●观察过程中硫乙醇摇的时候不能太剧烈 ●培养器的帽口不要弄到培养基 9 常规方法

9.1 培养条件:硫乙醇酸盐液体培养基在 32.5(+/- 2.5℃培养不少于 14天,大豆酪蛋白 消化培养基在 22.5(+/- 2.5℃培养不少于 14天

9.2 观察:

●在 14天的培养过程中定期观察培养基

●如果在 14天内观察到测试样品呈阳性,可以停止以后的观察 10 结果解释

10.1 只有一项或多项下列情况发生时,测试才可能被考虑为无效测试: ●无菌测试区域的微生物环境监控数据显示有错误发生 ●发现测试过程有错误 ●阴性对照发现微生物阳性

●测试污染微生物鉴定后, 能明确地将微生物生长归因于用于无菌测试使用的物料及 /或技术发生错误

10.2 无效测试可重新进行测试 七 无菌保证

1 一批产品的无菌保证不是通过 <71>无菌测试合格而得到的。而是通过建立恰当的经过验 证的灭菌工艺或无菌工艺过程,严格执行这些工艺过程的要求来得到的(cGMP 。

2 验证和证明灭菌工艺的基本原则

2.1 工艺与控制设备必须能按要求的参数运作

2.2 在有代表性的设备操作范围内重复进行灭菌工艺并引入产品或模拟产品 2.3 证明工艺是在方案中预设的限度内完成的

2.4 重复显示经过这样的工艺后, 微生物存活到位可能性在预设的限度内, 微生物指示剂经 常被使用以证明这一点

2.5 日常运作中参数的监控,设备、工艺的定期验证 3 概率

3.1 一批产品被称为无菌是跟据概率论来定义的, 说明该批产品中, 即使只有一个产品被污 染的可能性也是微乎其微,可以接受的。

3.2 通常被接受的无菌保证水平是 10-6的微生物存活率或更低,即保证经灭活的物品或产 品中有活的微生物的可能性不超过百万分之一。

4 D值

4.1 D值是将微生物减少 90%或 1个 log 所需要的时间(分钟 4.2 过度杀灭:

4.2.1 在与 D 值测定的同样条件下, 暴露于 12个 D 值的时间后就相当于典型的 “过度杀灭” 4.3 大量的灭菌工艺验证使用生物指示剂来确定物品暴露在灭菌条件下的时间, 以达到至少 为 10-6的无菌保证水平(SAL

5 生物指示剂

5.1 生物指示剂被广义的定义为:对特定灭菌工艺有抗性的特定微生物的制备物, 其特性经 过确认。

5.2微生物指示剂的耐受性必须大于灭菌产品中的自然存在的微生物。 5.3 根据微生物载量确定的灭菌工艺需定期对产品中的微生物数量及对验证条件的耐受性 进行评估。

5.4 灭菌方法 5.4.1 湿热灭菌

常用适当的杆菌菌株的芽孢 5.4.2 干热灭菌

5.4.2.1 不如湿热灭菌有效

5.4.2.2 在建立干热灭菌工艺过程中,经常用内毒素去热原研究替代微生物灭活研究,其速 度更慢。

5.4.3 气体灭菌

当物料无法承受湿热灭菌或干热灭菌的高温时,经常使用气体灭菌。 5.4.3.1 常用气体: ●环氧乙烷 ●气态过氧化氢 5.4.4 电离辐射灭菌 5.4.5 过滤除菌 5.5 无菌工艺过程 5.5.1 多级屏障系统

5.5.2 设施设备光滑,材料能耐受频繁的清洗、消毒 5.5.3 足够大的更衣室和物料储存室 5.5.4 准备室与灌装区的有效分隔 5.5.5 适当的气锁及风淋设施 5.5.6 风压、单向流、换气次数控制 5.5.7 湿度、温度控制 5.5.8 合理的消毒方案计划 5.5.9 人员培训等 5.6 无菌工艺验证包括: ●设备验证 ●过滤系统有效性

●环境验证,包括微生物环境 ●培养基模拟灌装等 八 无菌工艺

1 无菌产品必须在最严格的标准控制下产生。 1.1 无菌 Sterile :完全的明确地不含有活动微生物。

1.2 无菌 Aseptic :通过控制环境使污染保持在最低的风险程度,以去除活的微生物。

2 用于防止活的微生物在生产过程中的任何步骤中污染产品,对这些产品步骤而言,没有 任何的后续步骤可去除这些微生物。

3 控制措施: ●原料药 ●辅料 ●水 ●容器 ●密封系统 ●空气 ●表面 ●操作员 4关键要求

4.1 利用空气系统有效维护的恰当的设计,提供无活的微生物的空气环境 4.2 适当装备并更衣的经培训的操作人员才能进入 4.3 定期环境过滤器检查 4.4 常规粒子及微生物环境监测 4.5 可以包括定期无菌培养基灌装 5 洁净室和其他受控环境的微生物评估 6 洁净室分类的建立

6.1 FDA指南中的 Air Classifications 7 受控环境微生物评估计划的重要性 8 微生物警报限和行动限

8.1警报限:通常根据从特定的受控环境中的日常生产操作中得到的历史数据。 行动限:超过一定的微生物水平(cfu 时,需要立即的措施,必要时包括纠正措施。 8.2 从污染微生物数量,种类进行分析,了解环境情况潜在的变化,及时分析原因,采取行 动,使环境保持在要求的条件下

8.3 调查:

●区域维护文件回顾 ●清洁消毒文件回顾

●固有的物理或操作参数回顾,如环境温度及相对湿度的变化 ●及人员的培训状态 9 微生物鉴别 10 无菌模拟灌装

11 降低人与产品接触的系统 九 热原测试

1 热原:在体内达到一定浓度是会引起发烧的任何化学物质。

2 细菌内毒素:不同的革兰氏阴性菌在其细胞外膜中不同类型的脂多糖。 十 微生物替代方法的验证

1 验证的方法的目的在验证开始前被明确。

2 通则 <1223>提供指导如何验证一个方法以替代药典方法 2.1 微生物测试类型

2.2 样品中存活微生物的定量测试验证 ●准确度 ●精密度 ●专属性 ●定量限 ●线性 ●检测限 范围 检测限

耐受性 耐用性

耐用性 2.3 样品中存活微生物的定性评估验证 重复性

专属性

耐受性 3 比较验证要求证明替代方法同药典方法

相比较，符合其预期应用的要求。 根据上述情况， 微生物实验室应进行相应的调整， 以确保产品符合药典要求并严格控制产 品质量。