细胞用胰蛋白酶制备的新工艺研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２９卷总第７０期　西北民族大学学报（自然科学版）　Ｖｏ１．２９．Ｎｏ．２　２　００　８年６月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎ０ｒｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｊｕｎｅ，２００８　细胞用胰蛋白酶制备的新工艺研究　李明生　，李　倬　，冯若飞　，乔自林　，马忠仁　，冯玉萍　，侯兰新　，张福梅２　（１．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州７３００３０，２．西北民族大学理科实验中心，甘肃　兰州７３００３０）　峥　［摘要］用新鲜牛胰脏，采用盐析、层析、超滤方法对胰蛋白酶的提取和纯化工艺进行优化，探索一套胰蛋白酶制　备的新工艺．结果表明：此工艺比传统工艺的操作相对简单，周期短，只需一星期；酶比活和收率比传统工艺高，酶比活　可达２　３６８．５　ＢＡＥＥ／ｍｇ。收率为０．４８％．可为细胞用胰蛋白酶的产业化生产提供一定的理论和实验依据．　［关键词］胰蛋白酶；工艺；研究　［中图分类号］（／５５６　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００９—２１０２（２００８）０２—００２７—０５　胰蛋白酶主要是从牛、羊胰脏提取的一种蛋白水解酶．近年来，在生化制药、皮革以及食品加工等　方面显示了广泛的应用前景【１－－３』．美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司是全世界最大的胰蛋白酶生产商，其产品质量相　对于国内产品高，产品专供细胞培养所用．国内细胞用胰蛋白酶的开发才刚刚起步，产业化开发尚不成　熟．在与ＨｙＣｌｏｎｅ公司合作的过程中了解到，ＨｙＣｌｏｎｅ公司在制备胰蛋白酶时，注重原料的筛选，严格　控制产品质量，主要采用分级盐析、钙离子活化、透析、冻干等综合工艺技术，每年在我国的销售额达到　３　５００～４　０００万美元．国内在制备胰蛋白酶时，大都对原材料没有进行严格的筛选，控制质量研究内容　也不够全面，并且普遍采用乙醇或丙酮沉淀提取的传统工艺．此工艺酶活力损失较大、生产成本高、产　率低，试剂消耗量大且易燃、易爆，不仅造成大量的损失，而且污染环境，不利于安全生产．目前，国内几　乎所有科研与生产用户都依赖进口产品．本研究依据现代分离纯化技术，优化胰蛋白酶的生产工艺，为　细胞用胰蛋白酶的产业化提供一定的理论和实验依据．　１材料和方法　１．１材料设备　１．１．１材料牛胰脏（兰州民海生物提供）、Ｎ一苯甲酰～Ｌ一精氨酸乙酯盐酸盐（上海如吉科技发展有　限公司）、硫酸铵、柠檬酸、柠檬酸钠（均为国产试剂，ＡＮ）．　１．１．２设备超滤仪（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，型号：ＸＸ８２００２３０）、层析装置（上海嘉鹏科技有限公司）冻干机（上海　仪器厂）、离心机（上海仪器厂）、紫外／可见分光光度计（美国Ｔｈｅｍｅｒ，ｂｉｏｍａｔｅ５）．　１．２方法　１．２．１牛胰脏的处理方法将牛从颈动脉无菌采血致死，迅速去头剥皮后，将其移至层流罩下，开腹，　无菌取出胰脏，除去脂肪、结缔组织等，浸入预冷的０．１２５　ｍｏｌ／Ｌ硫酸中，迅速冷却，在０℃左右保存约　３０　ｍｉｎ，从酸中取出，绞成胰浆，迅速冷冻，备用．　１．２．２胰蛋白酶原粗品的制备取上述备用胰浆１　ｋｇ解冻，加入２倍体积的蒸馏水，混匀，用３　ｍｏｌ／Ｌ　［收稿日期］２００５—０５—２０　［基金项目］校级中青年项目ＸＢＭＵ一２００６一ＢＤ一８２。　［作者简介］李明生（１９７７一），男，陕西靖边人，实验师，硕士，从事生物工程与生物技术的教学与科研工作．　一２７—　维普资讯 http://www.cqvip.com 硫酸调节ｐＨ３．００，在４℃环境下搅拌２４　ｈ，无菌纱布过滤，滤渣再加入１倍体积的蒸馏水，同法收集滤　液，并合并两次滤液，调节ｐＨ２．５，４℃静置６　ｈ，４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心３０　ｍｉｎ，收集上清，过滤，量其体积，缓　慢加入硫酸铵使其达到０．７５饱和度，４℃静置过夜，使胰蛋白酶原完全析出．次日，４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　３０　ｒａｉｎ，弃滤液，收集沉淀，即为胰蛋白酶原粗品．　１．２．３胰蛋白酶原的活化　１．２．３．１活化方法参照文献【４Ｊ　１．２．３．２　ｐＨ对胰蛋白酶原活化的影响　称取同等重量的胰蛋白酶原粗品８份，分别加入１０倍体积的蒸馏水，使其完全溶解，并分别调ｐＨ　＝２、３－：，４、５、６、７、８、９，每份加入ｃａ．２　终浓度为０．３　ｍｏｌ／Ｌ的无水氯化钙和适量胰蛋白酶，室温活化．每　隔２　ｈ取样，依照＜中华人民共和国药典）（　】方法测定胰蛋白酶活性．　１．２．４胰蛋白酶的纯化将制备好的酶液平均分成３等份，分别用ＣＭ纤维素、ＣＭ—ｓｅｌ：，ｈａｒｏｓｅ—ＦＦ　离子交换剂及鸡卵粘蛋白亲和层析，均选择２．６×４０层析柱，收集峰值部分，比较３种层析方法的纯化　效果．　１．２．４．１　ＣＭ—Ｃ离子交换层析方法参照文献【６Ｊ．　ＣＭ—Ｃ处理一装柱一平衡一上样一洗柱一脱附一检测与收集　１．２．４．２　ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换层析　ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ处理，取２００　ｍＬ　ＣＭ～ｓｅｐｈａｒｏｓｅ～ＦＦ，直接用蒸馏水将其保护液洗净即可．　其余方法同ＣＭ—Ｃ离子交换层析．　１．２．４．３鸡卵粘蛋白亲和层析方法参照文献【７Ｊ．　鸡卵粘蛋白的活化偶联一装柱一平衡一上样一洗柱一脱附一检测与收集　１．２．５超滤将３种纯化的胰蛋白酶液分别用５、１０、２０、４０、８０倍体积的蒸馏水稀释，进行低压（Ｐ遗＝　１５　Ｐｓｉ，Ｐ回＝５　Ｐｓｉ）超滤纯化浓缩．浓缩后将各梯度收集的胰蛋白酶溶液冷冻干燥．　取６００ｍｌ嗨ｉ便　取出１００ｍｌ冻干　●　Ｉ，，—一加蒸馏水２０００ｍｌ（５倍）　超滤至　ｍ卜—　取出１００ｍｌ冻干　ｌ　／一加蒸馏水４００ｍｌ（１０倍）　超滤　０ｍ卜—　取ｆＩＪ　１００ｍｌ冻干　ｌ　厂加蒸馏水３００ｍｌ（２０倍）　超滤至　０ｍ卜——◆取出１００ｍｌ冻干　Ｉ　一一＿　１．Ｊｒ１蒸馏水２００ｍｌ（４０倍）　超滤至２ｇ０ｍｌ——＿◆取ｍ　１００ｍｌ冻干　ｌ　—一加蒸馏水１００ｍｌ（８０倍）　超滤至ｌ　ｍｌ——＿◆全部沈出冻干　一２８一　维普资讯 http://www.cqvip.com

２结果　２．１　不同ｐＨ值对胰蛋白酶活化结果　衰１不同ｐＨ对胰蛋白酶原活化实验衰　从表１和图２可以看出，胰蛋白酶原粗品液在ｐＨ：３，活化程度最高，而ｐＨ＝８时，活化程度较低．　有关文献报道［引，胰蛋白酶在ｐＨ为８左右活化．本试验通过对ｐＨ为２～８作梯度进行验证，结果表明　ｐＨ＝３，活化程度最高．　２．２三种层析方法结果　衰２三种层析方法实验衰　＾　●１　哪！￡　１ｌ　ＩＩｉｑ４ＤＩｌｌ：￣ｌｌ　图３　ＣＭ—Ｃ离子交换层析谱图　图４亲和层析谱图　图５　ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换层析　本试验采用ＣＭ—Ｃ纤维素、鸡卵粘蛋白亲和层析、ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换层析三种方法对　胰蛋白酶进行层析纯化．从表２可以看出，应用鸡卵粘蛋白亲和层析和ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换　层析方法纯化胰蛋白酶，纯化倍数分别为４．２倍和３．７倍，而ＣＭ—Ｃ离子交换层析方法仅为１．５倍，效　果明显低于前两种方法．同时，从图３、４、５中也可以看出：应用鸡卵粘蛋白亲和层析和ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　—ＦＦ离子交换层析方法纯化胰蛋白酶，从其峰面积、面积比、面积含量来看，其结果明显好于ＣＭ—Ｃ　纤维素．从表２和图５中看出，应用较为特异的鸡卵粘蛋白吸附胰蛋白酶的方法，其各项数据和指标都　略高于用ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换层析方法．从图４、５中可以看出，鸡卵粘蛋白亲和层析就收集　一２９—　维普资讯 http://www.cqvip.com

过程用时相对较长，需要３０２．７ｒａｉｎ，而ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ层析则只需要２１５．７　ｒａｉｎ，用时较短，在一定　程度上降低了由于纯化时间长而使胰蛋白酶失活的机率．　２．３超滤结果　表３梯度稀释超滤胰蛋白酶实验表　从表３可以看出：随着稀释倍数的增加，经超滤冻干后的胰蛋白酶，其蛋白百分含量和比活逐渐递　增，且４０和８０倍稀释纯化效果相对较好，综合考虑比活和收率，４０倍稀释超滤纯化是比较理想的选　择．　２．４胰蛋白酶提取和纯化过程活力测定结果　表４胰蛋白酶纯化过程比较表　从表４中可以看出：１　ｋｇ牛胰脏经过本试验各步优化条件的提取后，胰蛋白酶的比活可达２　３６８．５　ＢＡＥＥ／ｍｇ，非常接近于《药典＞规定的２　５００　ＢＡＥＥ单位／ｍｇ．同时也从表中看出，胰蛋白酶最终纯化了　８５倍，总蛋白含量为４．８２　ｇ，即收率为０．４８％，这也接近于文献［　］０．５５％的报道．　３结论　通过对细胞用胰蛋白酶制备的新工艺研究，一方面可为细胞用胰蛋白酶的产业化生产提供一定的　理论和实验依据；另一方面也可为疫苗生产和科研用户提供安全、可靠的胰蛋白酶．　４分析讨论　１）在胰蛋白酶粗提的过程中，由于此环节操作步骤相对较多，因此影响胰蛋白酶制备的因素也就　相对较多．尤其在胰蛋白酶原的活化时，ｐＨ值等都是影响胰蛋白酶原激活的主要因素，ｐＨ值太高，激　活的胰蛋白酶容易失活，ｐＨ值太低，有可引起蛋白变性．一般情况下，调节溶液的ｐＨ可改变目的蛋白　的溶解度，ｐＩ－Ｉ在等电点附近，蛋白的溶解性小，容易沉淀．但由于胰蛋白酶的等电点ｐＩ为１０．１，碱性条　件下极不稳定．因此，从本试验结果表明胰蛋白酶原在酸性环境下的活化程度较高，也可能与上述原因　有关．另一方面，有关资料报道［　，胰蛋白酶在活化时，存在分支反应，在ｐＨ值小于４时，加入氯化钙　可加速酶原活化而抑制其分支反应的发生，本试验结果与资料报道相一致．　２）胰蛋白酶纯化是整个工艺过程中重要的环节之一，选择一种或一套理想的纯化方法，是提高最　终胰蛋白酶活力的主要保证，从本实验对胰蛋白酶的纯化实验数据和实验过程可以看出：鸡卵粘蛋白亲　和层析虽然方法特异，纯化效果好，但其操作过程中用到一些化学剧毒品，大大降低了胰蛋白酶的安全　性，而且操作复杂、步骤繁琐、耗时长、影响因素多、稳定性差．ＣＭ—Ｃ纤维素离子交换剂相对安全，稳　一３０—　维普资讯 http://www.cqvip.com

定性好，但其分离效果相对较差，收率较低．ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换剂相对于ＣＭ—Ｃ纤维素而　言，具有多孔性、流动性好、机械强度高、化学稳定性好、置换性能强、流速快、分离效果好，而且由于介质　具有孔状结构，上样量也要比ＣＭ—Ｃ纤维素多，不需要特殊处理转型等繁琐步骤．相对而言，ＣＭ—　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ具有显著的优势．本实验采用的ＣＭ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ为国产试剂，价格也相对比较经　济实惠．因此，ＣＭ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ—ＦＦ离子交换剂是纯化胰蛋白酶比较理想的选择．　３）超滤也是现代分离纯化技术中所使用的重要方法之一，它在浓缩的同时也起到了一定的纯化作　用．在本实验胰蛋白酶的提取过程中有硫酸铵等一些无机盐离子加入，还由于原材料的地域以及动物　体的差异，难免从胰脏带入一些无机盐和重金属离子．由于一些过量的无机盐离子和重金属可大大降　低酶的活性【８．９］因此，本试验使用超滤技术，一方面对以层析的胰蛋白酶进行除盐浓缩，另一方面也可　以进一步纯化胰蛋白酶．　４）生物制品的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等，由于减压干燥和喷雾干燥都需要在　一定温度的条件下进行，不宜对胰蛋白酶进行干燥；冷冻干燥时在低温，低压条件下。利用水的升华性能　而进行的一种干燥方法．而且冷冻干燥后，生物活性不变，外观色泽均匀，形态饱满，结构牢固，溶解速　度快、残留水分低．因此，就胰蛋白酶的干燥方法而言，冷冻干燥法是一种较为理想的方法．　参考文献：　［１］何兆雄．动物生化制药基础［Ｍ］．北京：中国商业出版社，１９８５．　［２］胡学智．酶应用手册［Ｚ］．上海：上海科学技术出版社，１９８９．　【３］Ｌｕｏｎｇ　ＪＨ　Ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ　ｉｎｅｅｒｉｎｇ．１９８８。３１：５１６．　［４］金雨，李康群主编．现代生物制药［Ｍ］．当代中国音像出版社，２００４．６０２．　［５］国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［ｚ］．化学工　ｋ出版社，２００５，６２４—６２５．　［６］吴梧桐．生物制药工艺学［Ｍ］．中国医药科技出版社，２００１．３６，６５，３５８．　［７］孟国良．亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究［Ｊ］．郑州牧专学报，１９９６，１６（３）：１１—１５．　［８］郭勇．酶工程［Ｍ］．中国轻工业出版社，１９９４．１３５—１３６．　［９］徐风彩．酶工程［Ｍ］．中国农业出版社，２０００．１４０．　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｓ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＬＩ　Ｍｉｎｇ—ｓｈｅｎｇ，ＬＩ　Ｚｈｕｏ，ＦＥＮＧ　Ｒｕｏ—ｆｅｉ，ＱＩＡＯ　Ｚｉ—ｌｉｎ，ＭＡ　Ｚｈｏｎｇ—　ｒｅｎ，ＦＥＮＧ　Ｙｕ—ｐｉｎｇ，ＨｏＵ　Ｌａｎ—ｘｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｆｕ—ｍｅｉ　（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｇａｎｓｕ　７３００３０，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｕｓｉｎｇ　ｆｒｅｓｈ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ，ｔｒｙｐｓｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓａｌｔｉｎｇ—ｏｕｔ，ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｕｈｒａｆｉｈｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｆｌ　ｎｅｗ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｉｍｐｌｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｈｏｒｔｅｒ　ｌｅａｄ　ｔｉｍｅ（ｏｎｌｙ　ｆｌ　ｗｅｅｋ），ｈｉｇｈ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｙｉｅｌｄ　ｕｐ　ｔｏ　２３６８．５　ＢＡＥＥ／ｍｇ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　０．４８％．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｔｒｙｐｓｉｎ；ｐｒｏｃｅｓｓ；ｓｔｕｄｙ　一３１—