・ｌＯ・ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｅｓｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｒ． ２０１ １ Ｎ０．２ 菩提树一种新真菌病害初报 林琦，郑俊娟，，贺新生 （西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０） 摘要：该文报道了菩提树的一种新真菌病害。对植株叶绿素含量以及光合放氧能力测定的结果表 明，感病植株的叶绿素含量和光合放氧能力分别是健康植株的６４．９％和６１．０％，同化能力的降低 导致植株早衰、死亡。对采集标本的形态特征以及ＩＴＳ序列比对，鉴定该病原菌为柱状田头菇 Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ（ＤＣ．）Ｍａｉｒｅ的一个双孢菌株。 关键词：菩提树；病害；病原菌；柱状田头菇 中图分类号：￥７６３．１５文献标志码：Ａ文章编号：１６７１—０８８６（２０１１）０２—００１０—０３ Ａ ｎｅｗ ｆｕｎｇｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）ｉｎ Ｆｉｃｕｓ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ Ｌ．／ＬＩＮ Ｑｉ，ｅｔ ａ１．（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ ６２ １ ０ １ ０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｆｉｃｕｓ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ Ｌ．ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｘｙｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ，ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｘｙｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｗｅｒｅ ６４．９％ａｎｄ ６ １％ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ．ｔｈｅ ｗｅａｋｅｎｅｄ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ．Ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ａｎｄ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｉｓ ｆｕｎｇｕｓ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｂｉｓｐｏｒｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ（ＤＣ．）Ｍａｉｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆｉｃｕｓ ｒｅｌｉ８ｒｉｏｓａ Ｌ．；ｄｉｓｅａｓｅ；ｐａｔｈｏｇｅｎ；Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ（ＤＣ．）Ｍａｉｒｅ 菩提树Ｆｉｃｕｓ ｒｅｌｉｇｉｏｓａ Ｌ．是一种名贵的园林观 活力的衡量指标。采用分光光度法检测植株叶绿素 赏树木。目前对于榕属菩提树病原菌的报道中主要 含量 。选取健康植株和染菌植株新鲜叶各ｌ０片， 有拟木层孔菌Ｐｈｅｌｌｉｎｉｄｉｕｍ ｎｏｘｉｕｍ（Ｃｏｍｅｒ）Ｂｏｕｄａｒ— 去掉叶脉将叶片剪成碎片，四分法取样，最后各取叶 ｔｓｅｖａ ｅｔ Ｓ．Ｈｅｒｒｅｒａ、桑生小冠孢霉Ｃｒｉｓｔｕｌａｒｉｅｌｌａ ｍｏｒｉ— 肉组织０．２ ｇ，研磨时加入适量石英砂和少量 ｃｏｌａ Ｒｅｄｈｅａｄ、盘长孢状刺盘孢Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ＣａＣＯ ，防止叶绿素脂酶分解叶绿素。叶绿素溶液 ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｐｅｎｚ等¨ 。笔者从２００６年到２０１０ 用分光光度计（ｗＦＪ ７２００型，）进行测定，波长分别 年在西南科技大学校内连续观察到１株菩提树上的 为６４５ ｎｍ和６６３ ｎｍ。每个样品重复测定３次。计 １种真菌子实体，对该真菌引起的菩提树病害相关 算方法为：ＣＴ＝Ｃ ＋Ｃｂ＝２０．２９×ＯＤ６４５＋８．０５× 生理指标进行了测定，对病原真菌进行了鉴定。 ＯＤ ，，叶绿素含量（ｍｇ／ｇ）＝色素浓度（Ｃ ）×提取 １材料与方法 液体积（ｍＬ）／鲜重（ｇ）。 １．２．３ 光合放氧能力的测定 选取健康及病害树 １．１ 试验材料菩提树位于西南科技大学校园内， 叶，进行光合放氧能力的测定。将叶片剪成 其中１株染菌。病原采集于寄生在这株树干的子实 ０．１６ ｉｎｌｎ 大小，在１／１０ ０００电子天平上精确称重， 体（见图１—１），经组织分离、纯化后得到纯培养物 在３０ ｉｘｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７的ＮａＨＣＯ 溶液真空处理后光 Ａｇ０９，菌株保存在中国科学院微生物研究所中国普 通微生物菌种保藏管理中心（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３５）。 收稿日期：２０１０—０６—２２ １．２实验方法 基金项目：西南科技大学博士点建设基金 １．２．１ 树木症状观察定期观察、记录树木感病症 作者简介：林琦（１９８１一），男，四川绵竹人，在读硕士，助理农艺师 状和所致危害，并对出现的新鲜子实体拍照。 主要从事真菌分类及真菌病害研究。 通信作者，主要从事大型真菌资源调查及真菌病害研究，Ｅ—ｍａｉｌ １．２．２ 叶绿素含量的测定 叶绿素含量是植株生 ｈｅｘｉｎｓｈｅｎｇ＠ｓｗｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃａ 中国森林病虫 ２０１ １年３月 第３０卷 第２期 合放氧用ＯＸＹ—ＬＡＢ氧电极（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ，ＵＫ）测定， 恒温水浴保持反应室温度在２５℃，光强设定为 株菩提树，胸径为３０．５～３１．８ ｃｍ，高度约２０ １ＴＩ，树 龄基本相当。但其中１株由于感染病菌，生长势明 显弱于另一株，在不同的生长季节生长状况见图１ １ ０００ ｌｅｘ。通过氧电极自带软件绘制并计算出光饱 和曲线。计算公式为：光合放氧量（ｍｍｏｌ／ｈ・ｇ）＝吸 中的２ ；在春季发芽、新叶萌发时间相同，但新叶 生长不会转成正常的深绿色，很快转为浅绿带黄色。 在相同的生长季节感病株树叶提前５０～６０ ｄ变黄， 提前３０～４０ ｄ全部落叶，整体树叶泛黄、凋敝，生长 势明显弱于正常株。 感病植株树叶易脱落，稀疏，叶色呈黄绿、黄白。 叶脉细，呈黄白色。叶片较小，（３．７～４．２）ｃｍ× 收斜率（ｋ）×６０／树叶质量（ｍｇ），重复３次。以光 合能力的强弱来衡量其生活力的强弱。 １．２．４病原形态鉴定取成熟野生子实体，切取一 部分菌盖，沿菌褶的横切面做徒手切片。在Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００倒置显微镜下观察单孢萌发、菌丝结构，担子 形状、担孢子梗数量，孢子形状、颜色、大小、表面光 滑或有纹饰，并做好记录。 １．２．５ ＤＮＡ提取及ＩＴＳ序列比对 选取适量标 （１０～１２，５）ｃｍ，仅为健康树叶的２／３左右，叶片质 地较薄易破裂，而健康树叶片质厚，韧性强。 被菌丝侵染部分干朽，组织死亡，病原菌子实体 在整个树干（干朽和鲜活组织）均可发生，见图１—５。 本，按照改良ＣＴＡＢ法 提取其基因组ＤＮＡ，并对 ＩＴＳ区进行ＰＣＲ扩增。引物为ＩＴＳ４：５ 一ＴＣＣＴＣ— ＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ一３ ， ＩＴＳ５： ５ 一ＧＧＡＡＧＴ 病原菌在树上发生子实体的时问为７—１ １月， 阴雨连续５ ｄ以上发生。每年发生２～３次，每次可 ＡＡＡＡＧＴｃＧＴＡＡｃＡＡＧＧ一３“ 。反应体系为：模板 ＤＮＡ １ ＩｘＬ，１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（５０ ｍＭ ＫＣ１，１５ ｍＭ 采集到鲜子实体１～２ ｋｇ，子实体５～１４丛。 ＭｇＣ１２，１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ９）５ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚 合酶２ Ｕ，ｄＮＴＰ（１０ ｍＭ）１ ｔｘＬ、引物１ ｔｘＬ，补充去 ２．２叶绿素含量及光合放氧能力 叶绿索含量及 光合放氧能力测定结果分别见表１，２。结果表明， 病叶的叶绿素含量为２．５６ ｍｇ／ｇ，健康树叶的含量 为３．９４ ｍｇ／ｇ，病叶叶绿素含量仅为健康叶的 ６４．９％。病叶光合放氧量为９．２４ ｍｍｏｌ／ｈ・ｇ，健康 叶片为１５．１２ ｍｍｏｌ／ｈ・ｇ，病叶光合放氧量为健康叶 的６１％。两方面的结果能够互相印证。叶绿素含 离子水至５０ Ｌ。ＰＣＲ循环为：９４℃预变性４ ｍｉｎ， ９４℃变性３０ Ｓ，５５ ｏＣ退火３０ Ｓ，７２ ｏＣ延伸３０ Ｓ，３５次 循环，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增后产物直接纯化 后委托上海生工生物科技公司测序。将测序结果提 交ＧｅｎＢａｎｋ比对。 ２ 结果分析 量减少，光合能力降低，直接影响到树木同化能力的 降低，导致树木的生活力降低，抵抗力减弱。随着病 情发展，最终导致寄主死亡。 表１ 菩提树病叶与健康叶肉组织叶绿素含量的比较 ２．１ 对树木的危害和症状 我校新区同时移栽２ 表２健康与染病菩提树叶光合放氧量的比较 裂，稍突起，直径３～１０ ｃｍ，初期深褐色、茶褐 色，后渐变为淡褐色至淡土黄色，平滑或中部有较多 条纹。菌肉白色，厚１～２０ １ＴＩＩＴＩ。菌褶直生，中密，不 等长，无分叉，宽２—７ ｍｍ，初白色，成熟后呈污黄锈 色至咖啡色。有内菌膜，白色，开伞后形成菌环，厚 ０．５～１．５ ｍｍ，上位，不易脱落，有明显条纹。菌柄 中生或偏生，圆柱形，长３～１２ ｃｍ，粗径０．３～ ２．３病原真菌的形态特征子实体单生、丛生，中 ２．３ ｃｍ。内实，纤维质脆嫩，污白色，老时基部色稍 深，有皱纹及膜质鳞片。子实体采摘后基部流出或 到大型。菌盖幼时半球形，后渐伸展至扁平，少浅 ・１２・ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｅｓｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｒ． ２０ ｌｌ Ｎｏ．２ 滴出大量水珠（见图１—６） 孢子印暗褐色。孢子淡黄褐色，光滑，卵圆形或 椭圆形或不规则形，大小（１ １．０～ｌ２．８） ｍ× 菌丝直径２～２．５ ｍ． ．２．４ Ｉ．ｒｓ区序列比对结果 将测序得到的结果提 交ＧｅｎＢａｎｋ，序列号为ＨＭ４３７１６９。与ＢＬＡＳＴＮ比 对，结果显示与田头菇属真菌Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｓｐｐ．具有高 度的相似性。下载与其相似度很高有代表性种的 ＩＴＳ序列，菌株的ＢＬＡＳＴ比对结果显示，Ａｇ０９菌株 的ＩＴＳ Ｊ 歹Ｕ和Ａ．ｃｈａｘｉｎｇｕ（ＡＹ９０４３４１．１）序歹Ｕ （６．０～７．８） ｍ。大多数担子上有２个孢子，有部 分出现３孢，少见１孢、４孢（见图１—７）。 菌丝在ＰＤＡ培养基平皿上白色，生长浓密，有 同心圆环纹，气生菌丝不发达。容易在琼脂培养基 上形成形态完整的子实体，并大量弹射孢子。菌丝 透明，明显分枝，有明显的锁状联合（见图ｌ一８）。 Ｍａｘｉ—ｄｅｎｔ值达到９７％，ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ值达到 ９４％ １．着生于树干的子实体形态；２—４．分别为４月、９月、ｌ１月两树的生长情况，右边为感病植株；５．干部腐朽； ６．采摘后子实体明显的吐水现象； ７．担孢子梗和担孢子以及孢子的普通光学照片；８．单孢菌丝匕的锁状联合。 图１ 病害症状及病原特征 ３ 结论 参考文献 ［１ 徐悔卿，何平勋．中困木本植物病原前总汇［Ｍ ．哈尔滨：东北 林业大学出版社，２００８：１２８Ｉ． Ａｇ０９是一种菩提树新的病原菌，根据其形态学 特征可以确定其属于柱状田头菇，而ＩＴＳ序列比对 从分子水平证明了形态学分类 分离物经培养鉴 定，其学名为：Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｖｌｉｎｄｒａｃｅａ（ＤＣ．）Ｍａｉｒｅ，中 文名称：柱状田头菇。该菌株典型的特征是每个担 ［２ 李台生，孙群，赵世杰，等．植物 Ｅ理生化实验原理与技术 ［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２０００：Ｉ３４一Ｉ３７． ［３ｊ 王艺红，林俊芳，张炜阳，等．食用菌ＤＮＡ提取方法研究 Ｊ］． 食用菌，２００８（３）：ｌ８—２１． 『４ １ Ｗｈｉｔｅ ＴＪ，Ｂｒｕｎｓ Ｔ，Ｌｅｅ Ｓ．ｅｔ ａ１．Ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎ－ 子上着生２个孢子，应该是该种内的一一个特殊的双 孢菌株。柱状田头菇在我国一直作为一种栽培食用 菌，寄生于大型园林树木末见报道。连续观察得知， 该菌株通过树木伤口侵染，随着奇生的持续，导致树 ｃｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｇａ｜ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｉｎｎｉｓ ＭＡ，Ｇｅｌｆａｎｄ ＤＨ，Ｓｎｉｎｓｋｙ ＪＪ，ｅｔ ａ１．ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔＯ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｎｆｉｃ ｐｒｅｓｓ，１９９０：３ １５ —３２２． 木生活力降低、早衰，心材干朽腐烂，最终死亡。 （责任编辑杨静莉）
