无缝克隆同源重组克隆

Gibson assembly

）

简介（ INTRODUCTION

原理： Gibson assembly 是一种 one step, one pot 的迅速基因组装方法。它只要要将基因片段和需 要的三种酶混淆在同一个管内在 装置原理鉴于

50°C 下培育 15-60 min 就能够获得组装好的

过程依靠于三种酶：

DNA 。

DNA 片段间的重叠地区， DNA 外切酶（ T5 exonuclease ）, 高

保真 DNA 聚合酶。 （ Phusion polymerase ）和耐热 DNA 第一， T5 核酸外切酶消化

连结酶 （ Taq DNA ligase ）的共同作用。

因此 DNA 片段退火，

DNA 单链为模板， 沿 3' 方 DNA 单链黏合起来，密

DNA 片段的链 方向是从 5’到 3’. 每个 DNA 片段分别形成一个单链

的突出部分， 因为着这两个相邻的突出片段有一部分拥有同源性能够互补， 互补的序列从头配对连结。

而后，在空缺的部分 DNA 聚合酶以另一条

向将对应的脱氧核苷酸连结到单链上，填充缺口。最后，连结酶将两条

封裂痕。这样拥有重叠地区的 DNA 片段就组装成一整条 DNA 分子了。下边是组装的表示图。

资料（ MATERIALS ）

试剂（ REAGENTS ）

NAD ，H2 O ，1 M MgCl ，10 mM dNTP mix ，1 M Tris-HCl pH 7.5 ，50% PEG-8000 ， 2 ，1 M DTT

2.7 mg/ mL Tag ligase ，0.85

μ g/ mL T5_ExO，Phusion(1

)×、LB

培育基、抗生素（据载体而定） 、

LB 平板（相应抗性）

实验前准备（ SETUP ）

于冰水浴中配制以下反响系统。假如不慎将液体粘在管壁，可通太短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly buffer NAD

20 mg

无缝克隆同源重组克隆

H2O

1 M MgCl 2 1MDTT

10 mM dNTP mix 1 M Tris-HCl pH 7.5

300 μL 300 μL 300 μL 600 μL 3 mL 3 mL

50% PEG-8000

加水到 7.5 mL ，每管分 500 μL存于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱 ,够 3000 个反响

2×assembly mix: best combination: 100 reaction

2.7 mg/ mL Tag ligase 0.85 μ g/ mL T5_ExO Phusion(1 ×) 4× G.A. buffer

加水 365 μL，存于 -20 °C 冰箱，有效期

1 mL 10 μL 100 μL 25 μ L 500 μL

1 年。

实验步骤（

PROCEDURE ）

NEB 介绍同源片段的长度为

1. 设计引物经过 PCR 的方法在 DNA 片段的两头加上同源片段，

15-40 bp ，同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。

2. 进行 DNA 纯化： PCR 产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或许

进行重组反响，以 20 μL反响系统为例：

组分

PCR 产物回收试剂盒回收。

3.

加入量

Isothermal assembly Master Mix

10 μL

线性化载体 插入片段

Sterilized ddH 2O

10-100 ng (1- 2 μL)

8- 9 μL (3-5 ×载体 )

补足至 20 μL

50 °C 反响 15-60 min

4. 反响产物转变、涂板及克隆判定同传统分子克隆方法。

针对性建议

1. 在选择克隆位点时，应防止选择克隆位点上下游

50 bp 内有重复序列的地区。当克隆位点上

下游 20 bp 地区内 GC 含量均在 域 GC 含量高于 70% 或许低于

40% ～ 60%范围以内时，重组效率将达到最大。如这部分区 30% ，重组效率会遇到较大影响。

200 bp 的片段的组装；弊端之二是假如黏性 2. Gibson 组装克隆法弊端之一是合用与长度超出

尾端形成稳固的二级构造，如发夹构造或许茎环构造，那么成功率会大受影响。