毛细管电泳原理及其应用

毛细管电泳原理及其应用

学院：海洋港口学院 班级：14制药工程 学号：1423014113 姓名：蒋佳丽 时间：2015年1月7日

前言

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是近十几年来迅速发展起来的一种分离技术，虽说在上世纪六七十年代就有人对毛细管内电渗流形式做了理论探索并也开始尝试毛细管电泳技术，但都因为受到检测器灵敏度限制、电泳过程中产生的焦耳热无法有效散失等因素的制约，影响分离效果。八十年代初，外壁涂有聚二酞亚胺，内径小于100}m的熔融石英毛细管的使用[1]及检测器灵敏度的提高大大推动了毛细管电泳技术的发展，由于CE具有普通电泳和色谱的优点及具有高效、高灵敏度、快速、低运行成本、犬信息量和易于自动化等特点，近年来在生物化学、临床诊断、法医刑侦学等领域应用广泛。

一、CE设备及原理

毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的淌度及分配上的行为差异而实现分离目的的一类液相分离技术。其仪器装置一般由以下几部分组成(见图一)1.高压电源;2.毛细管;3.在线检测器;4.电极及电极液;5.加样系统。毛细管是由熔融石英加工制成的(内径20一100}m，长度为20一100cm )，外壁涂有一层聚二酞亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可根据需要涂上一层高聚物。与平板凝胶电泳类似的，毛细管内也可填充支持介质，如琼脂糖，聚丙烯酞胺及甲基纤维素等。

图一毛细管电泳仪装置示意图(Tagliaro, 1998)[1]

在线检测器位于距样品盘约三分之二至五分之四毛细管总长处，对毛细管壁内部进行光学聚焦(在此处的毛细管外壁的保护层是被烧掉或刮去的，以利于光的通透)。在线检测器通常有紫外、荧光和激光等多种检测方式。对DNA的分析通常使用紫外检测，对200bp的DNA片段的最小检测浓度是O.5mg/L。但对于生物样品中在和许多其他成分共存的痕量物质测定时，或对特殊分析(如DNA序列测定)时就要使用激光诱导的荧光检测器(laser induced fluorescence, LIF)，使用LIF在非液相毛细管电泳中的检测灵敏度要比非激光诱导的荧光检测提高6倍[2]，比紫外检测高100倍。另外，加入染料EB还可改善分离度，能将碱基长度相同但序列不同的DNA片段分开[3]。

毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，带电粒子在电场作用下以不同速度向其所带电荷反方向迁移，当pH>3时，毛细管内壁的石英分子因玫Siq分子的解离，而在表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，形成一个双电层。在高电压作用下，双电层水合阳离子层引起整个溶液在毛细管中向负极方向移动，形成电渗流。带电粒子在毛细管内的电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和，因此阳离子首先从负极流出;中性离子的速度等于电渗流速度，随后流出;而由于电渗流速度大于电泳速度，因此阴离子最后流出。

内壁石英分子除能造成电渗流外，还会吸附溶质中带正电荷的分子，从而影响分离效果。为了避免分析物被管壁吸附，可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点，或者选用pH接近pH2.0，此时毛细管内壁无解离的负电荷，但在这种酸性环境下，蛋白质容易失活，一般仅用于多肤分析。有时也可对毛细管内壁进行涂层，如中性共价涂层可以消除电渗，或采用改变内壁电荷的极性的可逆涂层方法，适用于等电点偏高的蛋白质的分离分析。尤其在蛋白质和多肤的分离分析中，毛细管内壁表面与分析物的疏水作用、静电作用、氢键、范德华力作用等都会影响分离效果。对毛细管内壁进行涂层有时是必须的[4]。

与平板凝胶电泳手工进样不同，CE现在多采用两种自动进样方式:流体力进样和电动进样。前者通过压力推动或真空吸人，无选择性;后者施加了电势，具有选择性，会因样品中组分的移动性和离子电荷不同而异。虽然电动进样具有选择性的优势，但进样过程会受到多种因素的影响，实际操作中应注意实验条件以获得更好的重复性。

二、CE的分离模式

根据分离机理不同，毛细管电泳大致可以分为以下几种模[1,5]:

2 .1毛细管区带龟泳(capillary zone electrophoresis, CZE)

毛细管中只有电泳缓冲液，根据待分离物质的荷质比差异进行分离，应用广泛。

2.2毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,%〔)

毛细管中填充有呈凝胶状的支持介质，这点与平板凝胶相似;也可以是甲基纤维素溶液，后者便于清洗，毛细管可多次使用。在溶液中，甲基纤维素分子在电镜下呈现缠绕状，其作用机理类似于凝胶的筛网作用。

2.3毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing, CIEF)

根据蛋白质和多肤的等电点进行分离。选用内壁中性共价涂层的毛细管，阳极端至检测器有效分离部分充

满两性电解质溶液，样品溶液夹于其中避免直接接触阳极液。两性电解质载体和样品在电场中聚焦至电流趋于零，通过压力或正负极加盐等方式，使不同等电点的样品组分逐一通过检测窗口。除了测定蛋白质和多肤的等电点外，还可以鉴

定蛋白质的纯度及分析不同的变异体，比凝胶等电聚焦具有更高的分辨率。

2.4微团电动毛细管色谱(micellar electrokinetic chromatography, MEKC或MECC)

在电泳缓冲液中加人一定浓度的去垢剂，如SDS及其类似物，这些分子丫端为亲水基团，其余部分为疏水结构，在溶液中聚集成一个个微团，称为假固相，被分析的样品根据其在假固相和溶液相中的分配进行分离。此方式主要用于小分子和多肤的分离。

三、CE在生物学中的应用

3.1核酸分子分析

传统中对于DNA的分离分析通常使用平板凝胶电泳。CE技术由于解决了电泳过程中焦耳热的散失问题，可以使用高电压，且可以在线检测，大大提高了分析效率。而且近年来激光诱导荧光检测( L1F)的使用也很大程度上提高了分辨率，因而在DNA序列分析和塞因突变分析中CE技术已经占据着越来越重要的位置。

3.1.1 DNA浏序

用CE进行DNA测序的报告很多，现在也有专门用于DNA测序的CE仪器。如毛细管阵列测序[6，7]。Sharon[8]等人利用方形毛细管阵列探索一种高通量快速的DNA测序方法，其检测激光束能在阵列内部增强，而折射和反射作用都大大减弱。

3.1.2 DNA突变筛选

对于突变位置已知，以PCR产物为基础的CE检测DNA点突变的筛选方法[[9]主要有PCR-RFLP, LCR和ASA几种。PCR - RFL}是利用所扩增的DNA片段内已知突变位点的限制内切酶位点进行CE检测，其片段分辨能力比普通琼脂糖凝胶电泳大得多;在链接酶反应(liga_se chain reaction, LCR)中，使用了两对互补的寡核昔酸探针，如果探针序列与靶序列完全互补，则探针与每个靶片段杂交并连接;如果靶片段中存在点突变，则不会产生连接产物。CE的分辨能力与聚丙烯酞胺凝胶分析相当，而时间仅为后者的十分之一;等位基因特异性扩增(allele-specific amplification, ASA)分析提供了一种能定量判断等位基因剂量的方法。在单个毛细管和毛细管阵列中，CGE已经应用于ASA基因分型反应和快速分析。

对于突变位置未知，以PCR产物为基础的CE检测DNA点突变的筛选方法[9]主要有HAP, SSCP, CDCE, faTR一PCR这几种。异源双链多肤性分析(heteroduplex poly-moiphism essay, HAP)是利用异源dsDNA分子存在碱基错配导致构象改变而在电泳中比同源dsDNA分子慢的特点进行突变检测的。在CE中添加甘油和EB来完成HPA分析。甘油能提高基质的猫度，改善分辨能力，低浓度EB能选择性渗人DNA分子的G-C配对区，夸大了异源双链和同源双链之间的结构差异;单链构象多肤性(single -strand conformation

polymorphism, SSCP)·则根据dsDNA变性后的单链DNA分子依其特殊序列折叠形成构象进行的分析。若突变发生在折叠的单链环内就不能检测。和常规的PAGE分析一样，在CE缓冲液中也加人甘油以增加ssDNA二级结构稳定性。现已成功应用CE检测结核杆菌和骨髓癌患者户3基因的点突变;一恒变性毛细管电泳(constant denature capillary electrophoresis, CDCE)是根据异源双链错配处低熔点区在变性胶解链而降低电泳速度来进行分析的，此dsDNA必须包含有G-C高熔点区；温度是影响CDCE的重要因素;定量反转录酶PCR ( quantitative reverse一transcriptase PCR,QTR- PCP) ,利用CE进行在线检测、峰面积定量和自动数据分析可直接反映体内基因表达情况，比通过染色PAGE或放射自显影照片扫描获得的间接数据更可靠更精确。

另外，值得注意的是分离dsDNA通常在毛细管内壁涂层以降低电渗流作用，Shi-Habi[10]等利用HEPES和高聚物HPMC作为分离缓冲液，在没有涂层的毛细管.中也成功分离了dsDNA，从而降低了成本。

3.2蛋白质和多肚分析

蛋白质和多肤的分析分离是毛细管电泳技术的最早应用之一，近几年来(王分析分离蛋白质多肤的发展迅速，

其应用范围已经扩展到生物医学的各个领域中。

蛋白质之间、蛋白质与其他分子之间的相互作用的研究是CE分析蛋白质的热点之一。tan. Sedzik[11]等人用CE研究蛋白质结晶作用，取得很好的结果。万谦[12]等建立了以CE为基础的测定蛋白激酶A活性的新方法，在这一方法中酶活力可用积分值计算，同时可以连续加样，在同一电泳中进行10个以上的酶活性测定，灵敏度和精确性均优于常规的同位素法。在临床诊断方面，孙生才〔”〕等尝试采用开口未处理的硅胶毛细管柱分离血清和血红蛋白，在10分钟内完成分析，分离效果优于传统的琼脂糖凝胶电泳，显示了CE在临床诊断中的应用前景。在LIF - CE上进行在线抗原抗体反应的免疫测定系统也已见报道。近年来，Melissa[ }a〕还在双毛细管二维CE技术基础上发展了三毛细

管的三维CE技术，对于复杂痕量生物分子方面有很大突破。

3.3小分子和离子分析

小分子分析目前在临床检测与药物分析中发展较快。如Tucci} }s〕等采用(;ZE一LIF在5---6秒内分析了100闪的脑透析液中兴奋型氨基酸的含量。CE在分析兴奋剂检测方面的应用也开始发展起来，并获得成功。

毛细管电泳技术灵敏度高、速度快，可以对样品进行定性定量分析，在分离生物活性分子方面显示了速度和效率优越性，今后将会有更广泛的应用前景。

参考文献

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[12」万谦等.一种新的侧定蛋白激酶活性的方法.生物化学与生物物理进展，1994，21 (3):267一270

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