PCR技术详解及分析_邓小红

重庆工商大学学报(自然科学版)

JChongqingTechnolBusinessUniv.(NatSciEd)

2007年2月

Feb.2007

　　文章编号:1672-058X(2007)01-0029-05

PCR技术详解及分析

邓小红,任海芳

(重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心,重庆400067)

摘　要:介绍了PCR技术的发展过程、工作原理、反应要素、应用及质控条件,并对常见PCR技术问题进行了深入分析,同时也对新发展起来的PCR技术(荧光PCR、交转录PCR、原位PCR、单细胞PCR等)做了介绍,并提出了关健性的解决方法。

关键词:聚合酶链式反应;原理;分析中图分类号:R281.4　　　　文献标识码:A

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点,是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

核酸研究已有100多年的历史,20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术。Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想,该设想在1985年被Mullis等人实现,他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件:模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间等。但Mullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow酶,它不耐高温,90℃时会变性失活,每次循环都要重新添加,同时其体外扩增的保真性较差,使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。直到1988年,Saiki等人从嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶(此酶被命名为TaqDNA多聚酶),才使得PCR技术得以广泛应用。

[1]

1　PCR技术的基本原理

[2]

PCR技术模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,该原理主要包括3个基本反应过程:变性———退火———延伸。变性主要是指双链DNA的变性,即双链DNA经加热至93℃左右,其热稳定性降低,配对碱基之间的氢键断裂,使双链DNA成为单链,以便与引物结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性(称为退火)。在此过程中,引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后,在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,进行体外的半保留复制,合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性———退火———延伸3个过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一次循环需2～4min,2～3h就能将目的基因扩增、放大几百万倍(图1)。

2　PCR的反应动力学

[3,4]

PCR的3个步骤循环进行,使得DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)

收稿日期:2006-09-10;修回日期:2006-12-01。

作者简介:邓小红(1977-),女,四川成都人,硕士,助教,主要从事分子生物学研究。

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计算,Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称为平台期(图2),它与PCR扩增效率、DNA聚合酶活性以及非特异性产物的产生等因素有关。

A-变性;B-退火;C-延伸

图1　PCR反应原理

图2　PCR反应动力学曲线

3　PCR扩增的反应要素

[5]

(1)引物。引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将目的DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:引物长度常以15～30bp左右,引物扩增跨度以200～500bp为宜;引物中G+C含量以40%～60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异第1期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　邓小红,等:PCR技术详解及分析

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条带,ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3′端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;引物中可以加上合适的酶切位点,以便于目的靶序列的分子克隆;每条引物的浓度为0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

(2)酶及其浓度。催化一典型的PCR反应约需TaqDNA聚合酶酶量为2.5U(总反应体系为100uL)浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

(3)dNTP。dNTP在温度较高时容易失活,因此需要-20℃下冰冻保存,以保证dNTP的质量。在PCR反应中,dNTP浓度应为50～200μmol/L,尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等,否则就会引起错配。

(4)模板。模板即DNA片段,其量的多少及其纯度的高低,是PCR成败与否的关键环节之一。(5)Mg浓度。在PCR反应中,各种dNTP浓度为200μmol/L、Mg浓度为1.5～2.0mmol/L时为宜。Mg浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增;浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

2+

2+

2+

4　PCR常见问题分析

(1)不出现扩增条带。PCR反应的关键环节包括模板DNA特性、引物的质量与特异性、酶的质量及活性、PCR反应条件等,应针对上述环节进行原因分析。首先,模板质和量的不同引起的反应效果可能也不尽相同,模板的来源不同,则在反应中的用量不同,扩增效率也会不同,如真核基因组DNA作为模板时,其使用量应比原核多,当然模板的纯度也有一定影响,如其中含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂时,会影响反应效率。其次,由于Taq酶容易失活或污染,会影响反应效果。第三,引物质量、浓度、两条引物的浓度是否一致是影响PCR反应的常见原因。第四,PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,最好于当日电泳检测,超过48h后带型不规则,甚至消失。

(2)假阳性。指阴性样品出现目的DNA扩增条带的现象,其原因是存在模板或扩增产物的交叉污染。这种污染有两种可能:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性的解决方法:①操作时应小心轻柔,防止将目的DNA吸入加样枪内或溅出离心管外。②所有能高压的试剂或器材均应高压消毒,所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

(3)非特异性扩增带。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或同时出现多个条带,包括特异性扩增带和非特异性条带。究其原应,首先是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体

2+

[7]

。

其次是Mg离子浓度过高、退火温度过低,或与PCR循环次数过多有关。再次是酶不合格或酶量过多。其对策包括重新设计引物,减低酶量或调换另一来源的酶,降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数,适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)等。

(4)出现片状拖带或涂抹带。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带,原因可能是模板降解,酶的用量过多或酶的质量差,也有可能是dNTP浓度过高,Mg浓度过高,退火温度过低,循环次数过多等引起的。解决方法包括更换模板,减少酶用量,适当降低dNTP的浓度和Mg浓度,增加模板量,减少循环次数。

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5　新发展的PCR相关技术

(1)反转录PCR。反转率PCR(ReversedTranscriptPCR,RT-PCR),是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法,其原理是先用寡聚胸苷作为引物在逆转录酶作用下,反转录所32

重庆工商大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第24卷

有mRNA成cDNA,再用拟扩增片段两端的两段引物PCR扩增该段cDNA。主要用于对表达信息进行检测或定量分析,可用于测定基因表达的强度,还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性,克隆mRNA的5′和3′末端序列,从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。

图3　反转录PCR原理

　　(2)实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR(RealtimeFluorescentQuantitativePCR)技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,主要利用加入PCR反应体系中的荧光基团或荧光染料来对扩增产物进行连续检测,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。实时荧光PCR技术分为两大类,第一类为荧光标记探针,如TaqMan探针、分子信标等

[6]

;第二类为双链DNA特异的荧光

染料,常用的有SYBRGreen和LCGreenTM。其中,TaqManTM技术主要是在一条寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团(R)和淬灭基团(Q)。当PCR扩增时,由于Taq酶的5′-3′外切酶活性,使探针上的荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,荧光监测系统可接收到该荧光基团的荧光信号,即每扩增一条DNA链,就可以测得一个荧光信号,因此,荧光信号的强弱与PCR产物的累积成正相关,从而可以进行定量分析。而SYBRGreenI是一种非饱和菁类荧光素,可以嵌合于DNA双链结构的小沟中,其处于游离状态时,检测不到荧光信号;当结合dsDNA后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到。荧光强度的增加与初始模板量成正相关,因此可进行定量DNA分析。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前,该技术已经应用于临床微生物、基因表达、肿瘤免疫、微小残留病变的检测,DNA拷贝数的测量、基因组变异和多态性等许多方面。

[7]

图4　实时荧光定量PCR的两种定量技术原理

　　(3)原位PCR。原位PCR(InsitupolymeraseChainreaction)技术的基本原理,就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来,从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。

PCR的扩增产物很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来,但PCR技术需要对细胞或组织第1期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　邓小红,等:PCR技术详解及分析

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加以破碎,并分离核酸,不能将扩增的结果直接在组织细胞中定位,因而不能确定靶序列所在的细胞和细胞类型。原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来,既可以快速、灵敏、特异性检测样品,又可以进行靶序列的细胞定位或组织定位。原位PCR技术的待检标本一般要先经化学固定,以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性,当进行PCR扩增时,各种成分,如引物,DNA聚合酶,核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内,以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板,于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大,或互相交织,不易穿过细胞膜或在膜内外弥散,从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位呈指数极扩增,扩增产物很容易被原位杂交技术检测。该技术自1992年由Nuovo等建立以来,得到迅速发展,目前已被成功地用于鉴定和定位许多低丰度靶基因,以及病毒、细菌、寄生虫等的检测

[8]

。

(4)单细胞PCR。单细胞PCR是以一个细胞所含的DNA或RNA为模板的PCR,发明始初主要被应用于一些特定的医学和神经生物学研究领域。与普通PCR相比,单细胞PCR在细胞识别与分离、模板制备、扩增反应策略方面有一定的特殊性。对于培养的细胞或其他游离细胞,可在倒置显微镜下手工机械分离或通过流式细胞仪分离

[9,10]

,而对于实体组织(如神经组织)可特异性染色后,采用激光捕获解剖法

[11]

(lasercapturemicrodissection,LCM)切割出目的细胞;或利用酶消化后,使组织解离为单个细胞,再用

荧光染料染色,然后利用荧光激活细胞分选法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)挑选出目的细[12]胞。为了解决RT-PCR模板少的问题,可以适当调高循环次数,也可采用巢式、半巢式PCR和多重PCR;或可先使用3′端扩增(TPEA)PCR法全面地扩增单细胞表达的全部mRNA,以增加模板量。单细胞PCR在技术操作上有较大难度,对实验室的要求颇高,但随着该技术的不断改进及与芯片实验室技术的结合,单细胞PCR在生命科学研究中将发挥更大的作用,为在单细胞水平上进行产前诊断、基因表达、DNA测序等领域的研究提供了简便而快速的方法。

5　结　语

近些年来,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对PCR技术进行研究和改进,使PCR技术得到了进一步地完善,并在此基础上派生出了许多新的PCR技术,如荧光PCR、反转录PCR、原位PCR、单细胞PCR等,以及这些技术相互融合,为生命科学领域的研究打开了一扇扇新大门,为分子生物学研究的深入开展提供了高质量的技术保障,也为公共卫生事业提供了方便、快捷、灵敏的检测手段。参考文献:

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Designofcomprehensiveinformationplatformofenvironment

protectionbasedon“3S”technology

ZENGWen-hua,CUIXia,LIAOShen-dong

1

2

1

(1.KeyLaboratoryofGuangdongRemoteSensingandGeographicInformationSystem,

GuangzhouInstituteofGeography,Guangzhou510070,China;2.GuangzhouResearchInstituteofEnvironmentProtection,Guangzhou510000,China)

Abstract:Rapiddevelopmentofnetworktechnology,communicationtechnologyandspacetechnologypro-videsnewtechnologicalmethodforenvironmentprotection.Basedonanalysisofcurrentsituationofdomesticur-banenvironmentprotectioninformation,thispaperoveralldesignsurbanenvironmentprotectioninformationsys-tembasedon“3S”technology,discussesoverallstructure,dataorganizationandfunctiondesignofthesystem

andelaborateskeytechnologiesofthesystemsuchasdevelopmentenvironment,systemintegrationandsoon.

Keywords:environmentprotection;3Stechnology;informationplatform;design

责任编辑:代晓红

(上接第33页)

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DetailedexplanationandanalysisofPolymeraseChainReaction

DENGXiao-hong,RENHai-fang

(ResearchCenterofPharmaceuticalChemistryandChemicalBiology,ChongqingTechnologyand

BusinessUniversity,Chongqing400067,China)

Abstract:Thispaperintroducesdevelopmentprocess,workingprinciple,reactivefactors,applicationandcontrolconditionofPolymeraseChainReaction(PCR)technique,makesdeepanalysisofgeneralproblemsinPolymeraseChainReaction,meanwhile,introducesnewdevelopmentoffluorescentPCR,cross-transcriptionPCR,insituPCR,singlecellPCRandsoonandprovideskeymeasuresforsolvingtheproblems.

Keywords:PolymeraseChainReaction;principle;analysis

责任编辑:田　静