一种农杆菌介导水稻遗传转化方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110607323 A(43)申请公布日 2019.12.24

(21)申请号 201910906344.1(22)申请日 2019.09.24

(71)申请人 四川育良生物科技有限公司

地址 610000 四川省成都市温江区成都海

峡两岸科技产业开发园青啤大道319号8-1-402号(72)发明人 顾勇　

(74)专利代理机构 成都时誉知识产权代理事务

所(普通合伙) 51250

代理人 沈成金(51)Int.Cl.

C12N 15/84(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01)

权利要求书1页 说明书3页

CN 110607323 A(54)发明名称

一种农杆菌介导水稻遗传转化方法(57)摘要

本发明公开了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：制备MS培养基，选取水稻种子，除菌后将种子均匀播种到MS培养基上；进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；活化农杆菌；侵染；转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；进行筛选培养；进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养，免去预培养过程，提高了愈伤组织分化能力，进而增加了出苗率。

CN 110607323 A

权　利　要　求　书

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1.一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：S1.制备MS培养基，在选用基础培养基后，加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；

S2.选取水稻种子，去颖壳；

S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；

S4.将S3中的MS培养基进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；

S5.活化农杆菌；S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；

S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；

S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；

S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S1中，所述基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S4中，备用的新鲜子叶放置在22-24℃的无光照条件下。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S5中，活化后的农杆菌含有目标基因。

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S10中，所述分化培养基9-10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。

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说　明　书

一种农杆菌介导水稻遗传转化方法

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技术领域

[0001]本发明涉及生物遗传转化领域，具体是一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。背景技术

[0002]随着人们对转基因方法的研究越来越多，其中，对农杆菌介导的转化方法研究较多，应用最广。而目前农杆菌介导的转化方法包括愈伤组织的诱导培养，愈伤组织的继代培养，侵染，共培养，农杆菌的去除，筛选培养，抗性愈伤组织的分化培养。存在周期较长，愈伤分化能力不强，导致出苗率低的技术问题。发明内容

[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，以至少达到减少预培养过程，提高愈伤分化能力，进而增加出苗率的目的。[0004]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：

[0005]S1.制备MS培养基，在选用基础培养基后，加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；[0006]S2.选取水稻种子，去颖壳；

[0007]S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；

[0008]S4.将S3中的MS培养基进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；[0009]S5.活化农杆菌；[0010]S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；[0011]S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；[0012]S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；

[0013]S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；[0014]S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。

[0015]优选的，在所述S1中，所述基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。[0016]优选的，在所述S4中，备用的新鲜子叶放置在22-24℃的无光照条件下。[0017]优选的，在所述S5中，活化后的农杆菌含有目标基因。

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说　明　书

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优选的，在所述S10中，所述分化培养基9-10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽

[0019]本发明的有益效果是：

[0020]本发明通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养，免去预培养过程，提高了愈伤组织分化能力，进而增加了出苗率。

具体实施方式

[0021]下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。[0022]实施例1

[0023]一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：[0024]S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；

[0025]S2.选取水稻种子，去颖壳；

[0026]S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；

[0027]S4.将S3中的MS培养基进行22℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在22℃的无光照条件下。[0028]S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。

[0029]S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；[0030]S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2d；

[0031]S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；

[0032]S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；[0033]S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基9d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。[0034]愈伤组织分化能力测定[0035]在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；[0036]相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为82％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。[0037]实施例2

[0038]一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：[0039]S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗

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说　明　书

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糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；

[0040]S2.选取水稻种子，去颖壳；

[0041]S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；

[0042]S4.将S3中的MS培养基进行24℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在24℃的无光照条件下。[0043]S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。

[0044]S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；[0045]S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养3d；

[0046]S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；

[0047]S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；[0048]S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。[0049]愈伤组织分化能力测定[0050]在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；[0051]相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为81％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。

[0052]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

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