动物医学进展，２０１８，３９（１０）：Ｉ－５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 牛布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条快速检测方法的建立 刘佳佳 ，吴 彤 ，梅 琳 ，韩雪清 ，吴绍强 ，林祥梅 ，王慧煜 （１．中国检验检疫科学研究院，北京１００１７６；２．内蒙古开鲁县家畜改良工作站，内蒙古开鲁０２８４００） 摘 要：为建立一种快速诊断牛布鲁菌病的方法，以原核表达、纯化的外膜蛋白ＯＭＰ２２作为抗原，以带 荧光标记的ＩｇＧ抗体作为标记物制备免疫层析试纸条，建立一种布鲁菌病快速检测方法，并对该方法的敏 感性和特异性进行验证。结果显示，制备的试纸条最低可检出１：１００稀释的牛布鲁茵标准阳性血清，且与 牛结核、牛蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫、牛巴氏杆菌病、牛白血病的血清无交叉反应；试纸条检测结果与 商品化ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（ＩＤＥＸＸ）的符合率为９３．５ 。以上结果表明，建立的荧光标记免疫层析试纸条 方法能快速检出牛血清中的布鲁茵抗体，具有良好的敏感性和特异性，是一种适合现场初筛的检测方法。 关键词：布鲁茵；快速检测；荧光；免疫层析试纸条 中图分类号：￥８５２．６１４；￥８５８．２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１８）１０—０００１－０５ 布鲁菌病（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）（简称布病）是由布鲁菌 常必要。研究发现布鲁菌外膜蛋白（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍ— ｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＯＭＰｓ）在免疫和诊断方面有着显著 （Ｂｒｕｃｅｌｌａ）引起的重大人畜共患病，以侵害动物生 殖系统，引起动物流产和不孕不育为特征ｌ】］。进入 ２１世纪，布鲁菌病疫情日趋加重，呈现从牧区、半牧 的优势，可作为替换ＬＰＳ的诊断抗原＿７ ］。其中， ＯＭＰ２２作为一种免疫优势抗原，在各种属之间的保 守性很高，是布鲁菌重要的毒力因子，是制造疫苗和 抗体必不可少的抗原。 免疫层析技术作为发展较为迅速的快速检测技 区向农区甚至城市蔓延的趋势，被ＷＨＯ称为“再度 肆虐”的传染病。包括美国等发达国家在内的１７０ 多个国家和地区都发生过或正在发生布病，这些国 家大都与我国有贸易往来，更为严重的是我国周边 国家疫情频频发生（如蒙古国、哈萨克斯坦、塔吉克 斯坦等）［２－３］，给我国布鲁菌病防控带来新的挑战。 我国针对动物布鲁菌病的防控以检疫、扑杀和 免疫综合治理为主，布鲁菌病的快速、准确诊断可为 术之一，以其简便、快速、特异性强、易于肉眼判断、 不需辅助仪器和试剂、结果易于保存等特点，特别适 合基层和现场初筛使用。其中，以荧光物质作为标 记物的免疫层析试纸条，因其特有的光电磁信号放 大系统可以提高检测的灵敏度，减少样品底色干扰， 疫病防控提供有效的疫情信息，是早期防控的关键。 细菌学诊断方法作为布鲁菌病诊断的金标准，结果 虽然具有较高的精确度，但是易污染、耗时长，且不 易分离，并且对工作人员的威胁较大。基于检测布 不存在胶体金显色难的问题，展现出更广的发展前 景Ｌ９。 。本研究采用原核表达的牛布鲁菌ＯＭＰ２２ 蛋白作为检测抗原，以带荧光标记的抗体作为标记 物，建立一种布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条检测 鲁菌脂多糖（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）的血清学诊 断方法，如虎红平板凝集试验（ｒｏｓｅ—ｂｅｎｇａｌ ｐｌａｔｅ ａｇ— ｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＲＢＰＴ）和补体结合试验（ｃｏｍｐｌｅ— 方法，以期为基层单位在现场快速准确初筛牛布鲁 菌病提供技术支持。 １材料与方法 １．１ 材料 ｍｅｒｉｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＣＦＴ），是世界范围内较为认可的 方法 ］，但因存在实验操作步骤繁琐、费时，在大量 样品的实地检测中应用较少。而基于布鲁菌全菌作 为抗原的ＥＬＩＳＡ检测方法亦不适合现场检测 Ｊ。 １．１．１ 菌株与血清ｐＣｏｌｄ—ＴＦ／ＯＭＰ２２原核重组 表达质粒为中国检验检疫科学研究院动检所构建保 存；牛布鲁菌标准阴性、阳性血清，购自中国兽医药 因此，建立一种快速并适合现场使用的诊断方法非 收稿日期：２０１７－１０—３０ 基金项目：公益性行业科研专项（２０１５１００１７） 品监察所；牛结核病血清、牛蓝舌病血清、牛病毒性 作者简介：刘佳佳（１９８９一），女，河北廊坊人，实习助理，硕士，主要从事畜共患病的实验室检测工作。＊通讯作者 ２ 动物医学进展２Ｏ１８年第３９卷第ｌＯ期（总第３０４期） 腹泻血清、牛口蹄疫血清、牛巴氏杆菌病血清、牛白 血病血清，中国检验检疫科学研究院动检所保存。 １．１．２ 主要试剂 荧光标记羊抗牛ＩｇＧ，上海优宁 维生物科技股份有限公司产品；兔抗羊ＩｇＧ，艾博抗 作为一抗，以１：２ｏ ０００稀释的辣根过氧化物酶标 记的羊抗牛ＩｇＧ作为二抗进行重组蛋白的ＥＬＩＳＡ 反应原性分析。最后，用ＴＭＢ底物显色液室温避 光反应１０ ｍｉｎ，用硫酸溶液终止显色反应，读取ＯＤ ４５０ ｎｍ值。 １．２．３ 荧光标记免疫层析试纸条的组装 （上海）贸易有限公司产品；玻璃纤维（ＧＦ一０８）、玻璃 纤维垫（８９６４）、吸水纸（Ｈ一５０７６）、黑色底板（国产） 和硝酸纤维素膜（ＨＦＣ１３５０２），上海捷宁生物科技有 限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。 １．１．３ 主要仪器 三维喷点系统（Ｂｉｏｄｏｔ— ＸＹＺ３０５Ｏ丁Ｍ）、切纸机系统（Ｂｉｏｄｏｔ—ＣＭ４０００丁Ｍ），百 道贸易（上海）有限公司产品；手持式紫外灯（ＢＧ一４２一 １．２．３．１ 样品垫和结合垫的预处理 将样品垫和结 合垫浸泡在含有表面活性剂１０ ｇ／Ｉ Ｔｒｉｔｏｎ１００和 ３０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ的ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）缓冲液中，于４℃条件 下浸泡２ ｈ，冻干保存备用。 １．２．３．２质控线（ｃ线）和检测线（Ｔ线）的反应性鉴 定 将荧光标记羊抗牛ＩｇＧ喷涂在结合垫上，兔抗 羊ＩｇＧ包被在ＮＣ膜上，利用湿法将蒸馏水滴加到 样品垫位置去爬膜，观察Ｃ线的显色情况。若Ｃ线 出现，表明整个试纸条层析过程是有效的；若未出 现，表明该反应失败。 Ａ）由中国检验检疫科学研究院提供；超纯水系统， 美国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司产品；电热恒温鼓风干燥箱 （ＤＨＧ一９０３０Ａ），上海中友仪器设备有限公司产品。 １．２ 方法 １．２．１ 重组蛋白的表达与纯化 将ｐＣｏｌｄ—ＴＦ／ ＯＭＰ２２原核重组表达质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩ ２１（ＤＥ３） 感受态细胞，挑取单菌落接种至含卡那霉素 （５０￣ｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养基中，３７℃摇菌至菌液ＯＤ ６００ ｎｍ值为Ｏ．６左右，加入诱导剂ＩＰＴＧ至终浓度 将荧光标记羊抗牛ＩｇＧ喷涂在结合垫上， ＯＭＰ２２蛋白包被在ＮＣ膜上，利用湿法将牛布鲁菌 标准阳性血清滴加到样品垫位置去爬膜，观察Ｔ线 的显色情况。若Ｔ线出现，说明阳性血清中的抗体 与荧光标记抗体结合形成复合物后，又与Ｔ线上包 被的牛布鲁菌重组蛋白发生特异性结合，表明该试 纸条具有检测能力。 １．２．３．３ 抗体浓度的优化 结合垫上荧光标记抗体 浓度及Ｃ线包被的二抗浓度是影响荧光信号强弱的 为０．５ ｍｍｏｌ／Ｉ ，１６℃继续培养２４ ｈ后收集菌液。 收集诱导后的菌体沉淀，加入结合缓冲液重悬 菌体后进行超声破碎至菌液澄清透明，于４℃离心 后，取上清过层析柱（按照ＱＩＡＧＥＮ公司的ＮＩ— ＮＴＡ ａｇｒｏｓｅ说明书进行操作）。先以含低浓度咪唑 （１０、２０、５０ ｍｍｏｌ／Ｉ ）的缓冲液洗脱去除杂蛋白，再 以含２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。 １．２．２ 重组蛋白的反应原性鉴定 将纯化好的 ＯＭＰ２２蛋白（蛋白浓度１ ａｇ／ｍＬ），以每孔１００ Ｌ 的量包被于酶标板上，４℃过夜。用１００ ｍＬ／Ｌ马血 清室温封闭１ ｈ，以１：ＩＯＯ稀释的布鲁菌标准血清 决定因素，可检测到最小荧光信号的量为试纸条包 被抗体的最佳用量。根据棋盘法原理，使用浓度为 １．５、０．７５、０．３７５ ｍｇ／ｍＬ的荧光标记羊抗牛ＩｇＧ，和 浓度为０．５００、０．２５０、０．１２５ ｍｇ／ｍＩ 的兔抗羊ＩｇＧ两 两组合进行包被，具体优化方案见表１。 表１ 荧光标记羊抗牛ＩｇＧ与兔抗羊ＩｇＧ的浓度梯度 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ ｂｏｖｉｎｅ ＩｇＧ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｓｈｅｅｐ ＩｇＯ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ 兔抗羊ＩｇＧ浓度／（ｍｇ·ｍＩ ） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ 羊抗牛ＩｇＧ浓度／（ｒａｇ·ｍＬ ）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ ｂｏｖｉｎｅ ＩｇＧ １．５００ ０．７５０ ０．３７５ １．２．３．４硝酸纤维素膜的预处理 将划好Ｃ线： 兔抗羊ＩｇＧ和Ｔ线：ＯＭＰ２２蛋白的ＮＣ膜置于 ３７℃烘箱中干燥２ ｈ后，用含１０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ和５ ｍＩ ／ 将包被有Ｔ线和ｃ线的ＮＣ膜按照黏性ＰＶＣ （３００ ｍｍ×６０ ｒａｍ）底板划分好的位置黏贴，要求左 右对齐，不要超出所划分的ＮＣ膜所在位置，然后轻 轻抹平膜面；将裁剪成３００ ｍｍ×２ ｍｍ的包被有荧 光标记抗体的玻璃纤维素膜，在ＮＣ膜的左侧压住 ＮＣ膜１ ｍｉｌｌ处，黏贴到ＰＶＣ底板上；将３００ ｍｍ× Ｉ Ｔｗｅｅｎ ２０的ＰＢＳ（ＰＨ ７．４）缓冲液浸泡２ ｈ，于 ３７℃烘箱中干燥４ ｈ后保存备用。 １．２．３．５ 试纸条的组装及结果判定 在水平桌面， 刘佳佳等：，｛ 菌荧光怀｝ 免疫』Ｚ－ 试纸杀快速榆删，Ｊ‘法的址、） ｌｃ】ｎ１ｎ 的 乃仟－ｉｆｔ 的破墒纤维豢ＩＪＩ１．在结合 侧许Ｊ ｉ 合 １ １１１【】１处 黏 刽ＰＶ（、底板Ｉ ； ＪＩ 将：．；（】（）ｌｌｌＩｌｌ ｌ ６ ｎｌ ｒｌ１【及水 靠ＮＣ膜 ＩＮ（、 １ ｎ…１．黏 刊ｌ Ｖ 呔饭 ｉ １ 刖 条饥 成 １．０ Ｉｌｌｌｌ 的试纸条． ｊ Ｔ：燥剂· 裟人销衔 Ｏ０ ｋｔｌ ｝ “ ｝ ｔ｝Ｉ密封．ｊ ｒ１。（保 。 愉测１（１１＿ ｌＩｌｆ．Ｔ线和（、线住紫外灯的 射卜均 蛳ｌ ７Ｉ】ｈｌ 斓 嘲嗣＿譬 …现紫 线． 为 鲁 抗体刚性； 顷控线九紫 线 现．则 纸条尤效．． １．２．４ 试纸条的敏感性捡测 使』ｌＩ ＪＩｌＵ一批次 纸 条榆洲稀释 为ｌ：１ ０、ｌ：ｊ（）、１：１【）｛】、】：２ ） １： （）的乍 停菌ｆ，Ｊ 准…性 清．将…脱ｍ性ｆ 的ｍ消 ｒ 、 稀释度ｆ１： 纸条的敏感度。 １．：．５ 试纸条的特异性检测 他门Ｊｌｌｄ·批次 纸 条分别 洲 ｆＯ 站骸桶ｍ 、牛醢舌 消、牛病薄 ５ 版泻ｍ消、个ｆＩ Ｉ蹄疫 清、，１ ｔ２氏朴 ｍ清、 卜ｌ ｉ ｇ Ｉｎｌ痫币【 １／ 痫 消．观察订尢交义悱 判断 纸 条的特 ｒ １．２．６ 试纸条的重复性检测 使川¨一批次＾乏／ｆ ㈨批次的 纸条分别柃删个布鲁 杯准阳性ｍ清卡¨ 准 １ Ｌ消． 验 价酞纸条的批内和Ｉ ｛｝［问 复 、 １．！．７ 血清样品的俭测 使用川·批次的荧光ｒ见 嫂层 纸条埘２００份 ｌ …．清样 ｆ （川ＰＢＳ缓 １液 １： （）稀释）ｊ韭｝ 榆 ０． ｌ／ｌｉＦｌ ｆ ｉ 果。ｆ ｌＩＪ以 １１）ＦＸ＼酞刹 （抓准Ｆｌ １ ．＼俭洲办法）作为埘比参 ，汁 巾ｆｌ愉测力‘法愉洲站泶的符合牢。 ２ 结 ．１ 重组蛋白的纯化及Ｉ Ｉ Ｉ Ａ鉴定 … １ 永．诱 表达的个 鲁菌币 Ｉ ｌ（）ＭＩ ２ （７，１ ｋ【Ｉ）为＿Ｉ『溶 表达。 ＮＩ ＮＩＡ ａ ｒ（］ 、 ｆ１Ｊ 忖 化 ．扶 ｒ纯瞍较＾’ 的蚩 、将 （）ＭＩ ２ 也被抗 ．刈中佃 ·ｌ 准 一 血消逊ｉ Ｉ Ｉ ＩＳＡ愉洲． ． 果 预 －致．说ＨＪ】陔 机Ｊ ¨ｊ‘ 为诊断抗 川卜 纸条的研制＿Ｊ：作 Ｉ Ｉ２．： 质控线（（、线）和检测线（Ｔ线）的反应性 荧圯 ； 抗 卜Ｉｇ（ ｆｌ１兔抗、 ｌｇ（ 可以发 特异 ｒ 悔．（、线 包情况良＆ 荧光 、ｒ ：１ 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ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｅｒｕｍ； ７．Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｓｅｒｕｍ 图３试纸条特异性试验结果 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ ＮＣ膜的特定位置作为Ｔ线，针对和信号物偶联的 兔抗羊ＩｇＧ包被在ＮＣ膜的特定位置作为Ｃ线，制 作检测布鲁菌抗体荧光免疫层析试纸条。结果表 明，该方法特异性好，与牛结核病血清、牛蓝舌病血 清、牛病毒性腹泻血清、牛口蹄疫血清、牛巴氏杆菌 病血清、牛白血病血清均无交叉反应；血清样品检测 图４试纸条敏感性试验结果 Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔＹ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｅｓｌ ｓｔｒｉｐ 结果与ＩＤＥＸＸ试剂盒的符合率为９３．５ ，说明该 方法在实际应用过程中与ＩＤＥＸＸ试剂盒ＥＬＩＳＡ检 种试验方法的符合率为９３．５ 。 测方法的使用效果基本相同．但偶尔也会出现假阴 性现象，可能与包被抗原的反应原性不够好有关，所 以仍需要进一步对试验所用牛布鲁菌外膜蛋白进行 更好的纯化或挑选更加优质的抗原进行研究。此 外，本研究采用间接法制备的试纸条存在荧光信号 偏崩的缺点，后续将制备抗ＯＭＰ２２的单克隆抗体 和多克隆抗体，采用夹心法原理，提高荧光信号和试 纸条检测灵敏度。 总之，本研究以牛布鲁菌外膜蛋白ＯＭＰ２２作 ３ 讨论 布鲁菌病是最重要的人畜共患病之一，其流行 与传播给全世界畜牧业和公共卫生事业带来了较为 严重的威胁，对其防控已成为全球关注的重大社会 公共卫生问题。血清学诊断方法是布鲁菌病常用的 诊断方法之一，而以ＬＰＳ作为包被抗原的Ｅｌ ＩＳＡ、 虎红平板凝集试验和试管凝集试验等方法，由于操 作步骤繁琐、费时，或结果常常存在假阳性和交叉反 应，因此在实际操作中应用较少¨ ］。布鲁菌外膜 蛋白具有较好的免疫原性和抗原保护作用，在免疫 和诊断方面表现出明显的优势［１ ３ １ ４］。ＯＭＰ２２蛋白 作为一种免疫优势抗原，欧建伟等 和Ｍａｒｔｉｎ— Ｍａｒｔｉｎ Ａ １等 ＝＝报道，缺失（）ＭＰ２２基因的绵羊 附睾布鲁菌在侵染ＨｅＩ ａ细胞和Ｊ７７４．Ａ１细胞时， 细胞增殖分裂能力有所下降，说明０ＭＰ２２基因可 为抗原，制备了诊断牛布鲁菌病的荧光标记免疫层 析试纸条。该方法操作简便，不需要特殊的仪器，不 需要专业操作人员，且在短时间内即可判断结果，基 本可以满足基层兽医单位或相关检疫机构快速检测 病原的要求，也为多种疾病联检试纸条的研制和多 标本快速定量检测方法的建立奠定了基础。 参考文献： ｒ１］ Ｒｏｓｓｅｔｔｉ Ａ，Ａｒｅｎａｓ－（３ａｍｂ【】ａ Ａ Ｍ，Ｍａｕｒｉｚｉｏ Ｅ，ｅｔ ａ【＿ＣａＤ一 １７Ｉｍｅ Ｄｒｕｃｅｌ ＬＯＳＩＳ：ａ ｎｌｓｔｏｒｌｃａＩ１Ｙ Ｄｅｇｌｅｃ１ｅａｕｌｓ ｅａｓｅ Ｗ１【ｎ ｍｇｎｌＩｌｅａｎ【 能与布鲁菌的感染力和毒性有关。Ｃａｒｏ—Ｈｅｒｎｄｎｄｅｚ Ｐ等¨ 也发现，缺失ＯＭＰ２２基因的Ｂ．ｏｖｉｓ ＰＡ菌 株在脾脏的增殖明显减少、稳定期生长不良以及抗 ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ［Ｊ］．ＰＩ ｏｓ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ。２Ｏ１７，１１ （８）：ｅＯ００５６９２． 体检测呈阴性等情况。本研究采用ＮＩ—ＮＴＡ ａｇｒｏｓｅ 亲和层析方法纯化牛布鲁菌ＯＭＰ２２外膜蛋白，并 通过ＥＩ ＩＳＡ方法验证其反应性。根据ＥＩ ＩＳＡ方法 检测布鲁菌的阳性值最低判定标准，ＯＭＰ２２抗原 具有很好的反应原性，可作为诊断抗原应用于牛布 Ｍｉｚａｎｂａｙｅｖａ Ｓ，Ｓｍｉｔｓ Ｈ Ｌ，Ｚｈａｌｉｌｏｖａ Ｋ，ａｔ ａ１．Ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｓｅｒ—。ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕ— ｍａｎ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｉｎ Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ［Ｊ］．Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００９。６５：１４－２０． Ｊｉａ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｌｕ Ｙ．ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｅａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ５９０ ｐａ— 刘佳佳等：牛布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条快速检测方法的建立 ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｉｎ Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ［Ｊ］．中国奶牛，２Ｏ１４（１５）：２３—２６． ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ，２０１７， ［１２］ 欧建伟，刘增再，谭丹，等．几种牛羊布鲁氏菌病抗体检测方 １１（５）：ｅ０００５５７７． 法的比较［Ｊ］．湖南畜牧兽医，２０１７（３）：３５—３６． Ｅ４］ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｉ，Ｏｌｉｖｉｅｒ－Ｂｅｒｎａｒｄｉｎ Ｖ，Ｄｕｂｒａｙ Ｇ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ［１３］ 冯宇，胡莉萍，朱良全等．蛋白质组学技术在布鲁氏菌病研 ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｔｅｓｔｓ（ＲＢＰＴ ａｎｄ ＣＦＴ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇ— 究中的应用及发展［Ｊ］．微生物学通报，２０１８，４５（０１）：１９１— ｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉ— １９６． ｏ１，１９９８，６４：６１－７３． ［１４］ Ｋｏｙｕｎｃｕ Ｉ，Ｋｏｃｙｉｇｉｔ Ａ，Ｏｚｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ［５］ 豆 玲，豆思远．牛布鲁氏菌病不同检测方法比较与试剂质控 Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ Ｒｅｖｌ ｎａｔｉｖｅ Ｏｍｐ２８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ［Ｊ］．畜牧兽医杂志，２０１８（２）：１０—１１，１６． ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｎｔ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｒｎｍｕｎｏｌ，２０１８，４３（１）：８１—８９． ［６］ Ｐａｔｒａ Ｋ Ｐ，Ｓａｉｔｏ Ｍ，Ａｔｌｕｒｉ Ｖ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｐ— ［１５］ Ｍａｒｔｉｎ—Ｍａｒｔｉｎ Ａ Ｉ，Ｃａｒｏ Ｈｅｍｄｎｄｅｚ Ｐ，Ｓａｎｃｈｏ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙ— ｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｍｐ２５／Ｏｍｐ３１ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｘ ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｂｒｕｅｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｄｉｓ，２Ｏ１４，８：ｅ２９２６． ＩＪ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，１３７（１－２）：７４—８２． ［７］ Ｌｉｎｄｌｅｒ Ｌ Ｅ，Ｈａｄｆｉｅｌｄ Ｔ Ｌ，Ｔａｌｌ Ｂ Ｄ，ｅｔ ａ１．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｂｒｕ— ［１６］ Ｅｄｍｏｎｄｓ Ｄ，Ｃｌｏｅｃｋａｅｒｔ Ａ，Ｈａｇｉｕｓ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｇｒｏｕｐ ３ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｏｍｐ２８，ａ ｐｒｏ— ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｇｏａｔｓ ｏｆ ａ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｄｅｌｔａ Ｏｍｐ２５ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ，２００２，７２：２３５— ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，１９９６，６４：２４９０—２４９９． ２３９． ［８］ 熊流新，黄健，张涛等．布鲁氏菌外膜蛋白Ｏｍｐｌ６的原核表 ［１７］ Ｃａｒｏ—Ｈｅｒｎｄｎｄｅｚ Ｐ，Ｆｅｒｎｄｎｄｅｚ—Ｌａｇｏ Ｉ ，Ｍｉｇｕｅｌ Ｍ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ 达、纯化及多克隆抗体制备［Ｊ］．现代医药卫生，２０１８，３４（５）： ｏｆ ｔｈｅ Ｏｍｐ２５／Ｏｍｐ３１ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ６６９—６７３． ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，２００７，７５（８）： ［９］ 李军涛．免疫荧光层析试纸条法检测食用油中的黄曲霉毒素 ４０５０－４０６１． Ｂ１口］．中国卫生检验杂志，２０１５，２５（７）：９６３—９６５． ［１８］ Ａｓｃｈｔｇｅｎ ＭＳ，Ｌｙｎｃｈ Ｊ Ｂ，Ｋｏｃｈ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ＥｌＯ］ 汤轶伟，张宏，崔芷萌等．荧光标记免疫层析技术在食品安全 ｆｉｓｃｈｅｒｉ ｆｌａｇｅｌｌａ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ 检测中的应用研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１８，３９（２）：３１４— ｈｏｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ￣．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。２０１６，１９８（１６）：２１５６—２１６５． ３１９． ［１９］ 刘翔．荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现［Ｊ］．电子 ［１１］ 郝璐，戴晓光，申 捷，等．几种布鲁氏菌病检测方法的比较 测量与仪器学报，２０１３，２７（９）：８５９—８６６． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｒｉｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ＬＩＵ Ｊｉａ—ｊ ｉａ ，ＷＵ Ｔｏｎｇ。，ＭＥＩ Ｌｉｎ ，ＨＡＮ Ｘｕｅ—ｑｉｎｇ ，ＷＵ Ｓｈａｏ—ｑｉａｎｇ ， ＬＩＮ Ｘｉａｎｇ—ｍｅｉ ．ＷＡＮＧ Ｈ ｕｉ—ｙｕ （１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１００１７６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｋａｉｌｕ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，Ｋａｉｌｕ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ，０２８４００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｂｒｕｃｅｌｌａ，ｔｈｅ ｒｏｃｏｍｂｉａｎｔ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＯＭＰ２２ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｓｅｒｖｅ ａｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏ— ｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ—ｌａｂｅｌｅｄ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ—ｌａｂｅｌｅｄ ｉｍｍｕｎｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ— ｐｈｙ ｓｔｒｉｐ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃａｎ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ １：１００ ｔｉｍｅｓ ｄｉｌｕｔｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｒａ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒｉｐｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａ１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＩＤＥＸＸ）ｗａｓ ９３．５ ．Ｉｔ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ—ｌａｂｅｌｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａ— ｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｒａｐｉｄｌｙ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖ— ｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｉｔ ｈａｓ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｓｅｒｕｍ ｑｕｉｃｋｌｙ ｉｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｒｕｃｅｌｌａ；ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ