1分子细胞生物学

1分子细胞生物学

RNA干扰（RNAinterference, RNAi）是指当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA（dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。

RNA干扰的作用机制
片段dsRNA在细胞内被Dicer酶切成长度大约为19-23nt的小片段干扰RNA（smallinterfering RNA，siRNA），由siRNA参与构成复合物
RISC(RNA-inducedsilence complex)。siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。

ES的鉴定：
转录因子：Oct-4,Nanog, and SOX2
抑制导致分化的基因表达，保持多能分化潜能

细胞表面抗原：

碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase, AKP)
阶段特异性胚胎抗原(stage-specificembryonic antigens, SSEA): SSEA3 and SSEA4 肿瘤排斥抗原(tumorrejection antigen, Tra):

Tra-1-60and Tra-1-81.
研究意义：

?人胚胎发育机制及影响因素的研究，基因的调控（基因治疗）；

?用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体和动物的实验及临床研

究；
?将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞、组织和器官。

细胞+二）分子水平的变化
?. DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、断裂、缺失和交
联，甲基化程度降低。

?2. RNA：含量降低。

?3. 蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。

?4. 酶分子：活性中心被氧化，金属离子丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点
发生改变，酶失活。

?5. 脂类：不饱和脂肪酸被氧化。

细胞衰老的分子机理
（一）差错学派
2.自由基(freeradicals)：是含量不成对电子的原子或基团，具有高度的反应活性。

如·OH,·H,CL·,CH3 ·
自由基攻击：导致DNA、蛋白质变异，正常细胞内存在清除自由基的防御系统：
?酶系统：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-PX)；

?非酶系统：维生素E，醌类等电子受体。

Orr和Sohal(1994),将SOD基因导入果蝇，其寿命比野生型延长1/3.

（一）差错学派

3.线粒体DNA突变：线粒体自由基浓度高，mtDNA是裸露分子，容易发生突变。●心，脑，骨骼肌氧气消耗量很大，组织最容易衰老。

●热量限制（calorierestriction): 延长大鼠寿命50%-70%。（二）遗传论学派

、复制性衰老：“Hayflick”极限，即细胞最大分裂次数。

?L.Hayflick (1961)报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限

的

（60~70代）。

?细胞增殖次数与端粒长度有关。

2、程序性衰老：如哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少；丙氨酸转氨酶A型---B型。、衰老基因学说
?长寿基因(longevitygenes):子女的寿命与双亲的寿命有关；各种动物都有相当恒定的

平均寿命和最高寿命；

?Caenrhabditis elegans的平均寿命仅20天，该虫age-1单基因突变，可提高

平均寿命65%，提高最大寿命110%。

?以蛋白质生物合成的延长因子Elongationfactor-1α（EF-1α）基因转基因

于果蝇生殖细胞，可使子代果绳比其它果蝇寿命延长40%。

衰老基因学说
?长寿基因(longevitygenes):子女的寿命与双亲的寿命有关；各种动物都有相当恒定的
平均寿命和最高寿命；
?成人早衰症(Werner?ssyndrome)：平均39岁时出现衰老，47岁生命结束；
?婴幼儿早衰症（Hutchinson-GilfordSyndrome）：1岁时出现明显的衰老，12~18
岁生命结束，
细胞凋亡的形态学特征
凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布
◆凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡

◆凋亡小体逐渐为邻近的

内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。

在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞

器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应。

细胞坏死染色质不发生凝集，不产生有规律的200bp左右的DNA降解片段，而是被随机降解。

细胞凋亡的生理和病理学意义

?生理学意义：
? 生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质

形成；

? 免疫细胞分化：95%的淋巴细胞发生凋亡；
? 防御：清除衰老细胞（c.elegans)、DNA损伤的细胞、以及被病原体感染的细胞。细胞凋亡的检测方法

?形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察
?DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带（DNAladders）
?脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
（terminal-deoxynucleotidyl
transferasemediated nick end labeling, TUNEL）TUNEL测定法：细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3?-OH末端。

?彗星电泳法（cometassay）
?流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧
光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周

期状态。?磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）