一种洛伐他汀羟基酸化物的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105147659 A (43)申请公布日 2015.12.16

(21)申请号 201510490570.8(22)申请日 2013.12.24(62)分案原申请数据

201310722852.7 2013.12.24

(71)申请人深圳华润九新药业有限公司

地址518029 广东省深圳市福田区上梅林凯

丰路2号(72)发明人胡昌勤 张斗胜 黄权华 佟军威

苏军权 何婷(74)专利代理机构广州三环专利代理有限公司

44202

代理人郝传鑫 熊永强(51)Int.Cl.

A61K 31/22(2006.01)A61P 3/06(2006.01)C07C 69/30(2006.01)C07C 67/297(2006.01)

权利要求书1页 说明书15页 附图9页

()发明名称

一种洛伐他汀羟基酸化物的应用(57)摘要

本发明公开了一种洛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用，该洛伐他汀羟基酸化物毒性显著降低，不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。

C N 1 0 5 1 4 7 6 5 9 A CN 105147659 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.洛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯取如式A所示的化合物洛伐他汀，加入乙醇和丙胺进行开环反应，制得如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯；

2)制备如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物

取步骤1)制得的如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，加入盐酸进行酸化水解反应，重结晶，制得如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物；

3)将如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物用于制备治疗高血脂的药物。

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CN 105147659 A

说 明 书

一种洛伐他汀羟基酸化物的应用

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本申请是针对于2013年12月24日提交到中国专利局、申请号为201310722852.7、发明名称为“一种洛伐他汀羟基酸化物的制备方法、组合物、组合物的制备方法及其应用”的母案申请作出的分案申请，上述母案申请的内容以引入的方式并入本文中。

[0001]

技术领域

[0002]

本发明涉及药物技术领域，特别是涉及一种洛伐他汀羟基酸化物的应用。

背景技术

他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇制

备限速酶HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇制备减少，从而反馈性刺激细胞膜表面低密度脂蛋白(LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低；他汀类药物还可抑制肝脏制备载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的制备方法和分泌。

[0004] 洛伐他汀为目前常用的治疗高血脂的药物，临床研究表明，洛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须在体内代谢、水解开环，形成具有活性结构的洛伐他汀羟基酸化物才能抑制HMG-CoA还原酶；洛伐他汀羟基酸化物的结构与普伐他汀钠极其相似，普伐他汀钠是已上市药物，具有很好的开发前景；而目前洛伐他汀羟基酸化物在洛伐他汀药物质量研究中仅作为相关物质控制，未有直接用于治疗高血脂方面的研究。

[0003]

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种洛伐他汀羟基酸化物的应用。[0006] 本发明提供了一种洛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用。[0007] 优选地，所述应用，包括以下步骤：

[0008] 1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯[0009] 取如式A所示的化合物洛伐他汀，加入乙醇和丙胺进行开环反应，制得如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯；

[0005] [0010]

[0011] 2)制备如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物

3

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说 明 书

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取步骤1)制得的如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，加入盐酸进行酸化水解反应，重结晶，制得如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物；

[0013]

3)将如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物用于制备治疗高血脂的药物。[0015] 优选地，所述步骤1)中在30℃～50℃条件下加入丙胺进行开环反应。[0016] 优选地，所述步骤1)中加入丙胺反应1h～5h。[0017] 优选地，所述步骤2)中用乙酸乙酯重结晶。[0018] 上述制备方法中，如式A所示的化合物洛伐他汀，其化学名为8-(2-(4-羟基-6-氧-四氢-2H-吡喃-2-基)乙基)-7-甲基-1、2、3、7、8、8a-六氢萘-1-基-2-甲基丁酯，其英文表述为8-(2-(4-hydroxy-6-oxo-tetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1、2、3、7、8、8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbutanoate；如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，其化学名为8-(3、5-二羟基-7-氧-7-(丙基氨基)庚基)-7-甲基-1、2、3、7、8、8a-六氢萘-1-基2-甲基丁酯，其英文表述为：8-(3、5-dihydroxy-7-oxo-7-(propylamino)heptyl)-7-methyl-1、2、3、7、8、8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbutanoate；如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物，其化学名为3,5-二羟基-7-(2-甲基-8-(2-甲基丁酰基氧基)-1、2、6、7、8、8a-六氢萘-1-基)庚酸，其英文表述为：3、5-dihydroxy-7-(2-methyl-8-(2-methylbutanoyloxy)-1、2、6、7、8、8a-hexahydronaphthalen-1-yl)heptanoic acid，这是本领域人员为简便而普遍采用的做法，本领域普通技术人员完全可以掌握的。[0019] 洛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须在体内代谢，水解开环，形成具有活性结构的洛伐他汀羟基酸化物才能抑制HMG-CoA还原酶；而本发明提供的洛伐他汀羟基酸化物，不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。

[0020] 本发明中洛伐他汀羟基酸化物的制备方法，其有益效果如下：[0021] 1.本发明的制备方法简单，原料易得，有利于工业化生产；[0022] 2.本发明使用试剂毒性较低，有利于环境保护；[0023] 3.本发明收率较高，达到97％以上。

[0024] 本发明提供了一种洛伐他汀羟基酸化物在制备用于治疗高血脂的药物中的应用，其有益效果如下：

[0025] 1.本发明毒性显著降低；

[0026] 2.本发明的洛伐他汀羟基酸化物不需要在体内代谢即可用于治疗高血脂。

[0014]

4

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说 明 书

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附图说明

[0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [00] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062]

图1洛伐他汀羟基酸化物结构式；

图2洛伐他汀羟基酸化物合成路线图；图3洛伐他汀羟基酸化物3D图；图4辛伐他汀羟基酸化物3D图；图5普伐他汀钠3D图；图6 1dqa3D图；

图7洛伐他汀羟基酸化物与1dqa对接结果；图8辛伐他汀羟基酸化物与1dqa对接结果；图9普伐他汀钠与1dqa对接结果；

图10洛伐他汀羟基酸化物与1dqa结合方式；图11辛伐他汀羟基酸化物与1dqa结合方式；图12普伐他汀钠与1dqa结合方式；

图13普伐他汀钠(50％-外包期-48hpf给药)对斑马鱼胚胎的毒性(3dpf)；图14洛伐他汀给药(50％-外包期-48hpf给药)对斑马鱼胚胎的毒性(3dpf)；图15辛伐他汀给药(50％-外包期-48hpf给药)对斑马鱼胚胎的毒性(3dpf)；图16洛伐他汀放置0h溶液HPLC色谱图；图17洛伐他汀放置24h溶液HPLC色谱图；

图18普伐他汀钠500ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图19普伐他汀钠500ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图20普伐他汀钠1000ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图21普伐他汀钠1000ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图22普伐他汀钠1000ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图23普伐他汀钠野生型对照(Wt)3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图24普伐他汀钠1500ug/ml 2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图25普伐他汀钠Wt 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图26普伐他汀钠Wt 2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；

图27洛伐他汀0.01ug/ml 1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图28洛伐他汀0.005ug/ml 1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图29洛伐他汀0.0005ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图30洛伐他汀0.001ug/ml 2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图31洛伐他汀0.001ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图32洛伐他汀Wt 2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图33洛伐他汀Wt 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；

图34辛伐他汀0.005ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；图35辛伐他汀0.03ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；

图36辛伐他汀0.05ug/ml 1dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；

[0063] 图37辛伐他汀0.01ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；[00] 图38辛伐他汀0.03ug/ml 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；

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说 明 书

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图39辛伐他汀0.01ug/ml 2dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形；[0066] 图40辛伐他汀Wt 3dpf作用于斑马鱼胚胎的畸形。

具体实施方式[0067] 实施例一

[0068] 一种如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：[0069] 1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯[0070] 取如式A所示的化合物洛伐他汀40.4g，加入400ml乙醇，30℃条件下加入丙胺29.5g进行开环反应1h，TLC检测至反应完全，冰水降到10℃结束反应，减压蒸出乙醇，制得如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯；

[0071]

2)制备如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物

[0073] 取步骤1)制得的如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，加入2mol/L盐酸溶液300ml室温搅拌1h进行酸化水解反应，用乙酸乙酯重结晶，制得如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物38.1g，收率94.3％(以式A所示的化合物洛伐他汀计)。

[0072] [0074]

实施例二

[0076] 一种如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：[0077] 1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯[0078] 取如式A所示的化合物洛伐他汀40.4g，加入400ml乙醇，40℃条件下加入丙胺29.5g进行开环反应5h，TLC检测至反应完全，冰水降到10℃结束反应，减压蒸出乙醇，制得如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯；

[0075] [0079]

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说 明 书

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2)制备如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物

[0081] 取步骤1)制得的如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，加入2mol/L盐酸溶液300ml室温搅拌1h进行酸化水解反应，用乙酸乙酯重结晶，制得如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物38.7g，收率95.6％(以式A所示的化合物洛伐他汀计)。

[0080] [0082]

实施例三

[0084] 一种如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物的制备方法，包括以下步骤：[0085] 1)制备如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯[0086] 取如式A所示的化合物洛伐他汀40.4g，加入400ml乙醇，50℃条件下加入丙胺29.5g进行开环反应3h，TLC检测至反应完全，冰水降到10℃结束反应，减压蒸出乙醇，制得如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯；

[0083] [0087]

2)制备如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物

[00] 取步骤1)制得的如式B所示的化合物洛伐他汀氨丙酯，加入2mol/L盐酸溶液300ml室温搅拌1h进行酸化水解反应，用乙酸乙酯重结晶，制得如式C所示的化合物洛伐他汀羟基酸化物39.3g，收率97.3％(以式A所示的化合物洛伐他汀计)。

[0088]

7

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说 明 书

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实施例四

[0092] 一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：[0093] 表1实施例四组分配比

[0091] [0094]

组分

洛伐他汀羟基酸化物聚山梨酯80羟丙纤维素交联羧甲基纤维素钠甘露醇微晶纤维素硬脂酸镁

欧巴代薄膜包衣预混剂

[0095]

重量(份)50.33940300.6适量

一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤(各组分用量按表

1所述)：

[0096] 1)称取洛伐他汀羟基酸化物、聚山梨酯80、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠、甘露醇和微晶纤维素，湿法制粒；[0097] 2)称取硬脂酸镁，压片；

[0098] 3)称取欧巴代薄膜包衣预混剂，包薄膜衣。[0099] 实施例五

[0100] 一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：[0101] 表2实施例五组分配比

[0102]

组分

重量(份)8

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洛伐他汀羟基酸化物聚山梨酯80羟丙纤维素交联羧甲基纤维素钠甘露醇微晶纤维素硬脂酸镁

说 明 书

200.33940300.6适量

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欧巴代薄膜包衣预混剂

[0103]

一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤(各组分用量按表2所述)：

[0104] 1)称取洛伐他汀羟基酸化物、聚山梨酯80、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠、甘露醇和微晶纤维素，湿法制粒；[0105] 2)称取硬脂酸镁，压片；

[0106] 3)称取欧巴代薄膜包衣预混剂，包薄膜衣。[0107] 实施例六

[0108] 一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物，按重量份计，包括以下组分：[0109] 表3实施例六组分配比

[0110]

组分

洛伐他汀羟基酸化物聚山梨酯80羟丙纤维素交联羧甲基纤维素钠

[0111]

甘露醇微晶纤维素硬脂酸镁

欧巴代薄膜包衣预混剂

40300.6适量重量(份)100.339

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说 明 书

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一种洛伐他汀羟基酸化物的组合物的制备方法，包括以下步骤(各组分用量按表3所述)：

[0113] 1)称取洛伐他汀羟基酸化物、聚山梨酯80、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠、甘露醇和微晶纤维素，湿法制粒；[0114] 2)称取硬脂酸镁，压片；

[0115] 3)称取欧巴代薄膜包衣预混剂，包薄膜衣。[0116] 一、在药效方面的比较[0117] 洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物分别为洛伐他汀和辛伐他汀的体内活性产物，二者均为HMG-CoA还原酶抑制剂，在体内不需要经过代谢，即可直接用于治疗高血脂，其药效比较见表4、表5。

[0118] 表4洛伐他汀与洛伐他汀羟基酸化物药效比较

[0119]

[0120]

从表4中可以看出，与洛伐他汀相比较，洛伐他汀羟基酸化合物具有更优的生物

利用度，更强的降血脂功能和更长效的治疗作用。

[0122] 表5辛伐他汀与辛伐他汀羟基酸化物药效比较

[0121] [0123]

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说 明 书

9/15页

从表5中可以看出，与辛伐他汀相比较，辛伐他汀羟基酸化合物具有更优的生物利用度，更强的降血脂功能和更长效的治疗作用。[0125] 二、利用对接分析评价洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物与普伐他汀钠对HMG-CoA还原酶蛋白(1dqa)的抑制作用。[0126] 1、配体选择

[0127] PUMBEDLINE查找洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物、普伐他汀钠信息见图3、图4、图5和表6。[0128] 表6配体信息

[0124] [0129]

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说 明 书

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[0130] 备注：①CID为化合物信息码，由PUMBEDLINE根据数据信息创建日期进行编号得

到。

②XLogP3代表疏水参数计算值，用来评价药物的脂水分布系数，采用了原子加合法换算而来。[0132] 2、受体选择

[0133] 由PDB蛋白库中查询的信息见表7，目前已发表有8种数据，分别对应不同类的他汀和底物结合部位，根据本次研究目的，选择1dqa作为受体，1dqa的3D图见图6。[0134] 表7 PDB蛋白库查询信息表

[0131] [0135]

3、对接准备

[0137] 首先对1dqa的构象进行最优化处理，对1dqa施加CHARm分子场，采用MM计算优化1dqa能量；对1dqa进行加氢、去除无效构象、残基后，选择1号活性位点作为对接口袋，其半径为15.0埃；根据配体和1dqa的性质，采用Dock Ligands程序进行半柔性对接。[0138] 4、结果

[0139] 对接结果见图7、图8和图9；配体与1dqa的结合方式见图10、图11、图12，可见洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠与1dqa具有相似的结合方式；普伐他汀钠、洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物与1dqa活性位点1的结合主要依靠配

[0136]

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说 明 书

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体中的氢原子分别与1dqa中LYS606、HIS635、SER637氨基酸形成氢键；另普伐他汀钠和辛伐他汀羟基酸化物还可与氨基酸LYS62形成Pi-Pi共轭键；分析评价洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物以及普伐他汀钠与1dqa的匹配程度，从而进一步评价其对HMG-CoA还原酶的抑制能力，结果见表8。

[0140] 表8 三种化合物与1dqa的匹配程度

[0141]

IndexNumber226

[0142]

12

[0143] [0144]

普伐他汀钠

114.250

123.460

157.340

1.148210

洛伐他汀羟基酸化物辛伐他汀羟基酸化物

-PLP1105.88082.330

-PLP2109.98091.070

PMF161.920149.000

RMSD1.1019901.092800

备注:①Index：索引。

②Number：数、名称。

[0145] ③PLP:(Piecewise linear potential)采用分段线性势能加和计算；得分越高表示配体与受体亲和力越强。根据对接过程中氢键参加与否，可分为PLP1和PLP2两种函数，PLP1不考虑氢键对接的影响；PLP2考虑氢键对对接的影响。[0146] ④PMF:(Potential of mean force)，采用分子间距离的平均能的加和计算；得分越高表示配体与受体亲和力越强。[0147] ⑤RMSD：化合物的对接构象与原始晶体构象的均方根差，表征预测结果与实际值在位置和构象上差异程度，单位为埃。[0148] 分子对接过程中，常采用打分函数用来评价对接程序(LigandFit)中，化合物与受体蛋白结合性的强弱。对于特定的蛋白质研究体系，一般往往需要多种不同的打分函数来验算对接结果；以避免单一打分函数由在其建立时选择的训练集分子的偏好性，缺乏普适性的缺点；从上述表8中可以看出，洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠与受体蛋白1dqa的对接构象中，PLP1、PLP2与PMF的得分值均较高，且各化合物间差值较小；同时RMSD均小于2.0埃，表示LigandFit对接结果准确；上述结果表明：洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物和普伐他汀钠抑制HMG-CoA还原酶作用相似，即它们具有相似的生物活性。[0149] 三、他汀类药物毒性比较[0150] 毒理学研究中，斑马鱼常用于各种药品的急、慢性毒性试验，其胚胎透明的特点更有利于观察胚胎不同阶段的结构和形态变化；在其幼体阶段，机体的各组织系统(神经系统、心血管系统、血液系统、肌肉骨骼运动系统、分泌、吸收和排泄系统等)已接近成熟和完善，开始发挥正常的生理功能，类似于成体。因此，斑马鱼胚胎阶段和幼体阶段可用于快速研究化合物的胚胎发育毒性和各组织器官的靶毒性。本研究利用斑马鱼模式动物比较研究了多种他汀类药物对胚胎发育的毒性，尤其是对肌肉组织发育的影响。[0151] 1、斑马鱼胚胎的给药方法

[0152] 收集胚胎后待胚胎发育至50％-外包期的状态，挑选发育正常的胚胎按每组30分

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说 明 书

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组，置于不同浓度的他汀药液中，每次试验均设野生对照组。[0153] 洛伐他汀、辛伐他汀用二甲基亚砜配制母液，使用前用人工海水稀释为所需浓度，由于母液为二甲基亚砜配置，为避免二甲基亚砜对胚胎产生影响，母液至少稀释100倍以上；测试液用人工海水稀释，在给药以后每天观察胚胎的发育状态，统计胚胎中死亡以及畸形的个数，并进行拍照。胚胎染毒后每天更换一次药液，给药处理持续至胚胎48dpf期(48hpf为从外包期到孵化48小时给药，其他以此类推)，将药液吸出，冲洗胚胎数次重新置于人工海水中使之继续发育。[01] 2、实验结果[0155] 1)洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀钠胚胎毒性的比较[0156] 洛伐他汀和辛伐他汀为非活性内酯结构的前药，必须分别在体内代谢开环形成洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物才能抑制HMG-CoA还原酶；而普伐他汀钠则以羟基酸化物的形式存在；普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀作用于斑马鱼胚胎(50％-外包期-48hpf)在3dpf致畸致死范围如图13、图14、图15所示(3dpf为从外包期到孵化3天给药，其他以此类推)。

[0157] 表9 三种化合物对斑马鱼胚胎的影响比较

[0158]

三种他汀类药物在相应浓度范围内对胚胎致畸作用呈浓度依赖性逐渐上升；从

致畸致死的浓度范围来看，辛伐他汀的作用浓度稍高于洛伐他汀，而普伐他汀钠的作用浓度则远高于辛伐他汀和洛伐他汀，即普伐他汀钠的毒性远低于辛伐他汀和洛伐他汀，从而可以说明洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的药物毒性小于非活性内酯结构的前药。

[0160] 由表9、10可以看出，从三种他汀类药物早期作用于斑马鱼胚胎的致畸致死严重程度显示，洛伐他汀最严重，其次是辛伐他汀，最不严重的是普伐他汀钠，并且不同类别的他汀类药物对斑马鱼胚胎达到相同的致畸或致死效果时浓度的差异是十分明显的，例如对早期斑马鱼胚胎毒性最大的洛伐他汀的100％致死剂量与毒性最小的普伐他汀钠的100％致死剂量相差达到了十万倍，而普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀三种药物的分子量差距较小，三种他汀类药物在临床上的推荐使用剂量也相差较小，但是在作用于早期斑马鱼胚胎的毒性却差异较大。

[0161] 表10.六种他汀类药物作用于斑马鱼胚胎致畸致死浓度比较

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从化学结构上来比较普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀，其相对分子质量非常接近；普伐他汀钠以具有活性的羟基酸化物结构存在,但洛伐他汀和辛伐他汀是非活性内酯

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结构形式存在；普伐他汀钠对斑马鱼胚胎致畸致死作用远小于洛伐他汀和辛伐他汀；普伐他汀钠其血浆蛋白结合率远小于洛伐他汀和辛伐他汀，约为洛伐他汀和辛伐他汀的50％，显示其在体内主要以游离形式的药物存在，但毒性却远远小于洛伐他汀和辛伐他汀；上述结果显示开环后形成的洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的毒性分别与洛伐他汀和辛伐他汀的非活性内酯结构相比，其毒性作用明显减轻。[0165] 2)洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物的胚胎毒性比较[0166] 洛伐他汀、辛伐他汀溶液24h后进行HPLC检测分析，从检测结果可以看出，洛伐他汀、辛伐他汀24h后均基本以洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物形式存在。[0167] 表11洛伐他汀和辛伐他汀比较结果

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备注：WT为野生对照型，也就是作为对照的不添加药物的胚胎。

[0171] 从表11中可以看出，当给药浓度增大到0.01ug/ml，洛伐他汀与辛伐他汀在0、24h的正常胚存活数显著下降，当浓度增大到0.1ug/ml，洛伐他汀与辛伐他汀的总存活和正常胚存活数均为0；结果表明给药浓度达0.01ug/ml以上，洛伐他汀与辛伐他汀均表现出胚胎毒性。

[0172] 3)他汀类药物作用于斑马鱼胚胎的致畸性[0173] 他汀类药物对斑马鱼进行染毒后，每日观察一次，记录统计主要的畸形形态并拍照；由图18～图39的图片可以看出普伐他汀钠、洛伐他汀、辛伐他汀这三种他汀类药物虽然作用于早期斑马鱼胚胎的浓度范围差异较大，但影响胚胎的早期发育的表型形态却较为相似，与洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物导致的毒性反应表型也相似，主要集中在以下几个方面：

[0174] ①胚胎整体体长变短，卵黄囊延伸变短粗，尾干弯向左右体侧；高浓度组运动能力降低，用发圈触碰反应不如正常对照组敏感；[0175] ②胚胎发育过程中色素受影响，整体减弱；[0176] ③胚胎有淤血出现，出现淤血的部位主要集中在头部、躯干背部以及卵黄囊延伸末端的尾干部位；

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④斑马鱼胚胎在一定浓度下都发现心包肿大现象，同时出现心脏带状畸形；[0178] ⑤处理组胚胎躯干处肌肉组织都出现异常，体节不清晰，在各组的最高浓度组体节有平行化的趋势。[0179] 3、分析结论

[0180] 1)他汀类药物作用于斑马鱼胚胎致畸致死浓度范围：在斑马鱼胚胎早期发育50％-外包期-48hpf给予不同浓度浓度的六种他汀类药物进行作用，结果表明六种他汀类药物作用早期胚胎致畸致死的浓度范围差异很大，差异最大的达到上万倍；三种他汀类药物作用于斑马鱼胚胎的致畸致死严重程度依次为：洛伐他汀最严重，其次是辛伐他汀，再其次是洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀的羟基酸化物，最不严重的是普伐他汀钠。[0181] 2)毒性：洛伐他汀和辛伐他汀内酯键开环分别形成洛伐他汀羟基酸化物、辛伐他汀羟基酸化物，毒性至少降低了50倍；但由于降解后还产生了其他相关物质，故洛伐他汀羟基酸化物和辛伐他汀羟基酸化物的毒性比测定的更低。[0182] 3)畸形：他汀类药物的作用于早期斑马鱼胚胎虽然浓度差异很大，但引起的畸形大体上是一致的，主要有胚胎整体体长变短、卵黄囊延伸变短粗、尾干弯曲；色素减弱；头部、躯干背部以及卵黄囊延伸末端的尾干部位淤血；心包肿大现象、同时出现心脏带状畸形；胚胎躯干处肌肉组织都出现异常，在各组的最高浓度组体节有平行化的趋势。[0183] 以上结合实施方式是对本发明的详细说明，只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限定本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

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