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大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

来源：小侦探旅游网

　浙江中医药大学学报2006年3月第30卷第2期

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及

生物学特性研究

　　余　勤,连俊兰,王　艳,郭　莹,万海同

浙江中医药大学　杭州　310053

摘要:[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(ratmesenchymalstemcells,rMSCs)和体外传代培养技术,并对rM2

SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离rMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生

长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后rMSCs的生长、增殖情况。[结果]rMSCs在体外培养扩增,原代可获得(5～6)×105、第5代可获得(2～3)×108个细胞。rMSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,rMSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是rM2

SCs,具有rMSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。

关键词:间质干细胞;骨髓;生物学特性;大鼠

中图分类号:R39212　文献标识码:A　文章编号:100525509(2006)0220189204

StudyonMethodofExpandingandCulturingRatMesenchymalStemCellsinvitroandItsBiologicalCharacteristicsYuQin,LianJun2lan,WangYan,etalZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou(310053)

Abstract:[Objective]Toestablishamethodtoseperateratmesenchymalstemcells(rMSCs)fromratmarrow,culturerMSCsinvitro,andstudyitsbiologicalcharacteristics1[Methods]rMSCswereseperatedfromratmarrowwithwall2stickingmethodandexpandingculturedinvitro1Todrawthegrowthcurvesofcellsat1th,3th,5thpassage,detectthesurfaceantigenswithflowcy2tometry1ToevaluatetheeffectoffetalcalfserumwithdifferentconcentrationstorMSCs1[Results]Therewereapproximately(5

～6)×10cellsafterprimarycultureandover(2～3)×10rMSCsat5thpassage1TheappearanceofrMSCsislikeshapeofspearanditsgrowthcurvesarelikeshapeofS1TherMSCswerepositiveforCD90andnegativeforCD451[Conclusions]CellsseperatedandculturedbythemethodestablishedinthisexperimentwererMSCs1TheyhavethebiologicalcharacteristicsofrMSCs,andaregoodresourcesforstudyintissueengineering1

Keywords:mesenchymalstemcells;marrow;biologicalcharacteristics;rat

　　骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是成体干细胞之一,具有多项分化潜能,可分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种组织细胞[122],是组织工程中重要的种子细胞之一,具有广泛的应用前景。本实验成功建立了简便高效的大鼠MSCs分离方法,并对其生物学特性进行了研究,现将结果报告如下。1　材料和方法111　实验动物　健康Wistar大鼠(120g左右,浙江中医药大学实验动物中心提供)。

112主要试剂　DMEM/F212(Invitrogencorpora2tion)、L2DMEM培养基(Invitrogencorporation);胎牛血清(FCS)(Hycolnecorporation)、0125%胰蛋白酶21mmolEDTA(Invitrogencorporation)、CD902PE

小鼠抗大鼠单抗(Ebiosciencecorporation)、CD452

FITC小鼠抗大鼠单抗(BDBiosciencecorpora2tion)、MouseIgG12PE、MouseIgG2a2PE(Caltagla2boratoriescorporation)、青霉素、链霉素(Invitrogencorporation)。

113　rMSCs的体外分离和原代培养　将大鼠断颈

处死,浸入75%酒精中5min,无菌条件下取出股骨、胫骨,剔除脂肪组织,露出骨骺端,用5ml含10%胎牛血清的DMEM/F212冲出骨髓,充分混匀后,1000rpm离心10min,制成单细胞悬液,细胞重悬于

含10%胎牛血清的DMEM/F212培养液,1只大鼠股骨及胫骨骨髓细胞量接种于1个T225cm2塑料培养瓶内,置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2细胞培养箱培养。12h后弃去未贴壁细胞,更换培养液,以后

实验论著

　　基金项目:国家自然科学基金资助计划项目(No:30371789);浙江省科技厅资助项目(No:2004C33014)

Fundproject:Supportedbynationalnaturalsciencefund(No:30371789);SupportedbyZhejiangProvincialsci2techbureau(No:2004C33014)

作者介绍:余勤,浙江中医药大学教授。

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每3～4d换液1次。贴壁细胞接近80%～90%融合后,结束原代培养。

114　rMSCs传代扩增培养　取出贴壁细胞接近80%～90%融合的T225cm2塑料培养瓶,用0125%胰蛋白酶21mmolEDTA约1ml消化2min,待细胞形态开始皱缩,用含10%胎牛血清的DMEM/F212培养液约115～2ml终止消化,并加入3～5mlPBS,反复轻轻吹打,移入离心管,1000r/min离心5min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F212培养液,按1∶3比例传代培养。115　rMSCs的生长曲线绘制　取P1、P3、P5代细酶消化分散成单个细胞悬液,用血球计数板计数每

孔的细胞数,比较两种培养液不同浓度血清下细胞的生长、增殖情况。2　结果

211　rMSCs的分离和扩增　大鼠骨髓单个核细胞悬液接种于塑料培养瓶后,12h细胞完全贴壁,倒置显微镜观察,此时贴壁细胞呈圆形、短梭形或三角形,核位于中央,散在分布于瓶底。12h更换培养液后,2～3d出现长梭形贴壁细胞(见图1)。3～4d培养瓶底圆形细胞减少,梭形细胞增多,并可见到少量细胞集落形成,初期的细胞集落由几个或几十个细胞组成(见图2);5～6d圆形细胞进一步减少,而梭形细胞集落增多,细胞形态逐渐变为长梭形。集落中心细胞密度增大,外周细胞逐渐稀疏,呈放射状分布,细胞集落大小不等;1周左右,细胞密度进一步增加,细胞接近80%～90%融合时原代培养结束(见图3)。原代培养消化后细胞数达(5～6)×105。刚传代的细胞呈圆形,簇状分布。传代后12h,细胞散在均匀分布于瓶底,形态重新变为长梭形成纤维细胞样,生长潜伏期较短,为1～2d,2～3d是细胞快速增殖期,5～6d传代1次。扩增至5代时获得(2～3)×108个细胞。212　rMSCs生长曲线　rMSCs生长曲线呈S形,接

余　勤,等:

胞制备单细胞悬液,调整细胞浓度为1×104/ml,接μl,每3d换液1次。从种在24孔培养板,每孔200第2天起每隔24h计数3孔的细胞数,取其平均值作为该天的细胞数,绘制9d的细胞生长曲线。116　rMSCs表面抗原检测　取扩增传代的1、3、5

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究代细胞,用0125%胰蛋白酶21mmolEDTA消化收获细胞,PBS洗涤2次后制成5×105/ml的单细胞悬液,分别加入抗CD90、CD45单抗,室温孵育30min,流式细胞仪(FACSVantage型)检测。

117　不同浓度胎牛血清对rMSCs生长的影响　传

至第3代的rMSCs以2×104/ml相同细胞密度分别接种于不含FCS(0%)和含5%、10%、15%、20%不同浓度FCS的DMEM/F212和L2DMEM培养液的24孔板内,每个浓度3孔,每孔培养液1m1,置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养3d后,用胰

种后第1、2天为潜伏期,从第3天开始细胞增殖加速

进入对数生长期,第6～7天达到高峰,以后进入平台期(见图4)。

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213　rMSCs的表面抗原表达　流式细胞仪检测结(P<0105)。在10%～20%血清浓度之间,随血清

果显示细胞均一性较好,其中CD90呈阳性,而CD45浓度的增加细胞数有所增加,但各组细胞数无显著

表达阴性(见图5)。差异(P>0105)。显微镜下观察,20%血清浓度组,214　不同浓度胎牛血清对rMSCs生长的影响　我细胞状态差,部分胞体变宽,并有漂浮细胞。rMSCs们比较了在L2DMEM和DMEM/F212两种培养液在L2DMEM和DMEM/F212两种培养液各血清浓中,加入0%、5%、10%、15%、20%五种不同浓度的度组间细胞计数结果无显著性差异(P>0105)。结FCS对rMSCs生长的影响,结果如表1。无论是哪果表明,血清浓度过高或过低均不利于的生长,故本种培养液,血清浓度大于等于10%时rMSCs都有显实验选用含10%浓度血清的培养液。

著的生长,与含0%、5%浓度血清组相比,差异显著

表1　在不同浓度血清的培养液中培养3drMSCs细胞数(×104,x±s)培养液

0%5%10%15%20%L2DMEM0127±010531166±015633133±01583137±01553140±0120DMEM/F212

0133±0106　2133±0157　4134±0166

4140±0170

4145±0156

　　与10%、15%、20%FCS组比较,3P<0105

3　讨论

方向伸出伪足。因成纤维细胞样细胞在数量上占优

　　骨髓中MSCs的含量很低,约为01001%～

势,所以传代后的细胞呈均一的梭形。

0101%左右,要利用MSCs就必须实现MSCs的体本研究表明,在生长过程中,rMSCs同样经历潜外分离培养和扩增,因此,如何从贴壁的异质细胞群伏期、对数增殖期和平台期,生长曲线呈S形,符合中分离得到较为纯化的MSCs具有十分重要的意正常细胞的生长特性,且倍增时间短。原代结束后义。目前用于分离MSCs的方法主要有3种:(1)贴可获得(5～6)×105个细胞。传代后rMSCs贴壁时壁筛选法:在功能上,骨髓主要由造血细胞和基质细间缩短,增殖速度加快,接种后5h就有90%以上细胞组成,MSCs是基质细胞中具有自我更新和多向分胞贴壁,每传代1次细胞数可增加2倍左右,扩增至化潜能的细胞群,在体外造血细胞以悬浮方式生长,5代细胞数可达(2～3)×108个细胞。表明该分离培基质细胞以贴壁方式生长,所以采用贴壁筛选法,利养获得的rMSCs在体外有较强的扩增能力,本研究用MSCs可长期传代特性去除杂的粘附细胞,得到所采用的细胞培养条件适于rMSCs的纯化和扩增。MSCs。(2)密度梯度离心法:根据MSCs与其他细实验过程中我们发现,原代培养12h后换液的方式胞的密度不同而将其分离出来。目前常用相对密度对细胞增殖影响较大,如用PBS缓冲液清洗细胞2为11073的Percoll对人MSCs进行分离(通常认为～3次再进行培养,细胞增殖明显比未清洗的要快,这部分细胞中包含MSCs)。rMSCs密度公认的范这可能是因为简单换液仍保留了少量的造血干细围尚未明确,因此本研究未采用此法分离大鼠rM2

胞,能分泌促进造血干细胞增殖的因子,引起造血干SCs。

(3)流式细胞仪分选法:研究表明细胞表面蛋白细胞大量增殖,一方面降低细胞纯度,另一方面又抑如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性,制rMSCs的增殖。因而PBS清洗能去除造血干细CD14、CD34、CD45造血谱系标记则表达阴性[1]。因

胞,有利于rMSCs的增值。

至今尚未筛选到MSCs特有的标记分子,用流式细目前常规的细胞表面抗原单抗尚不能特异性检胞仪分选法对MSCs分离时以上标记可作一定的参测MSCs,一般认为粘附分子CD29、CD90CD44等考,但意义不大且价格昂贵。所以,目前的分离方法是MSCs的重要表面标记[1]。MSCs与造血干细胞都不能获得高纯度rMSCs,且无法对分离出的rM2共同存在于骨髓中,但研究结果显示MSCs不表达SCs进行直接鉴定(因其缺乏特有的标记分子)。常造血干细胞表面抗原,如造血干细胞标志抗原CD34用的鉴定方法是通过在培养过程中出现分化表型,、白细胞标志抗原CD45等均为阴性,证明MSCs为逆推其为MSCs。因贴壁筛选法具有操作简便,费用非造血类细胞。本实验研究表明,细胞在多次传代低廉,效果切实可靠的优点,故本研究采用贴壁筛选仍保持其增殖能力,细胞形态趋于一致,流式细胞仪法获得rMSCs。进一步培养,贴壁细胞呈现多种形检测结果显示所得细胞表达CD90,而不表达CD45,态,主要为成纤维细胞样细胞,呈长梭形,带有223个表明本实验从大鼠全骨髓细胞分离纯化和扩增而获突起,细胞核较大,扁圆形;部分为扁平的不定型细得的细胞属于rMSCs,而非造血类细胞。

胞,细胞扁平,胞体较大,形态不规则,胞浆可向不同

研究rMSCs体外培养,在血清浓度的选择方面,191

余　勤,等:

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有多种不同报道[425],尚无统一的具体浓度值。所以如何选择血清的浓度对rMSCs体外培养至关重要。本研究选用美国Hyclone公司生产的FCS,对比不同浓度下rMSCs生长情况。实验结果显示,无血清和含5%血清浓度下细胞生长受限,而20%血清浓度下细胞形态变差,10%～15%血清浓度是rMSCs生长的适宜范围,L2DMEM和DMEM/F212两种培养液中的情况相近。本实验结果表明,血清浓度过低或过高均不利于rMSCs的生长。因此我们选用含10%胎牛血清的DMEM/F212作为rMSCs的最适合培养条件。如何选择优良的rMSCs骨髓来源,也是本实验研究目的之一。同种大鼠不同年龄不同体重都可能影响到的rMSCs的贴壁、增殖和纯化,为此,我们比较了不同年龄(体重)的Wistar大鼠来源的MSCs生长情况。研究发现体重低于80g以下大鼠的rMSCs原代培养,首次换液后细胞数少,增殖缓慢,6～7天形成3～5个集落,原代融合时间较长。而从体重大于150g大鼠骨髓中分离所得细胞,细胞数量多,密度过高,一周左右圆形细胞发生形态变化,可见散在的梭形细胞,无集落形成,有较多脂肪细胞出现。这可能是由于幼年动物骨髓腔内是以未分化、具有多向分化潜能的各种幼稚细胞为主,单核细胞和巨噬细胞含量非常丰富,但动物太小所获得的骨髓亦过少,不利于快速培养扩增rMSCs。而成年动物长骨骨髓腔内是以脂肪细胞占多数的黄骨髓为主,以成

年动物长骨骨髓为细胞来源,培养出的细胞可能是以脂肪细胞为主,而骨髓间质干细胞少。因此我们选择了1月龄(120g左右)的大鼠作为细胞来源,实验证实其取材方便,培养所获得的细胞生长良好,形态一致,培养结果稳定,具有较高的分化潜能,可以作为组织工程研究中良好的细胞来源。

参考文献:

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(收稿日期　2005212224)

余　勤,等:

　大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究坚持办刊宗旨　以特色求发展

———《浙江中医药大学学报》介绍

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