如何选择有关物质测定的对照

有关物质杂质的定量方法

有关物质杂质的定量方法根据杂质与主成分的最大吸收波长及校正因子来确定。若杂质与主峰的吸收波长基本一致，则一般采用自身对照法或峰面积归一化法；若杂质与主峰的吸收波长差异范围较小，校正因子在0.9～1.1之间，则可采用不加校正因子的主成分自身对照法；超出该范围，校正因子在0.2～5.0范围以内时，采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正；若杂质与主峰的吸收波长相差较大，校正因子在0.2～5.0范围以外时，不能通过校正因子校正，则要采用外标法进行测定。

①外标法（杂质对照品法）

 外标法定量比较准确，采用外标法进行测定时，应进行相应的方法学研究。

 A 检测波长的选择 检测波长的选择测定方法参照紫外-可见分光光度法（中国药典2010版二部附录ⅣA）进行测定，或采用HPLC法，DAD检测器进行测定。同时考察辅料干扰等。

 B 标准曲线 线性关系应在设计的测定范围内测定。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行测定，至少制备5个浓度。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。

 C 精密度试验 仪器精密度试验主要是考察测定方法在所用的试验仪器测定结果的偏差，精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

 测定方法：取一定浓度的杂质对照品溶液，连续测定次数至少6次，以峰面积的测

定结果计算相对标准偏差，考察仪器测定的。

 D重复性试验 重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。重复性测定可在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的试样，各测定3次，或100％的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价。常用的测定方法时采用100%的浓度，测定6次，计算测定结果的相对标准偏差。

 测定方法:按含量测定的方法，分别平行称取6份样品，按外标法测定杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。

 E 中间精密度 中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度。验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析人员、设备。考察在不同因素变动的条件下，测定结果的标准偏差。

 测定方法：按含量测定的方法，分别由不同的人员、时间、不同仪器按外标法测定样品杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。

 F 回收率试验 回收率试验来验证测定方法的准确度。试验设计需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即测定9次，报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。并考察不同浓度下测定结果的相对标准偏差。

 测定方法：按含量测定的方法，按加样回收率测定方法，在已知杂质含量的样品中加入不同浓度的杂质对照品，按外标法分别测定不同浓度样品中的测的量，计算测的量比加入量的百分含量（即回收率），以不同浓度下的回收率计算相对标准偏差。

 G 杂质的检测限 检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；最低检测限不得大于该杂质的报告限度，以保证检出需控制的杂质。

 测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为3：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。同时将信噪比为3：1的样品溶液进样6针，以峰面积计算相对标准偏差。

 判断结果：最小检测限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应≤20%，以最小检测限来确定供试品溶液配制的浓度作为依据。

 H 杂质的定量限 定量限是指被测杂质能够被定量测定的最低量。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。

 测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为10：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。同时将信噪比为10：1的样品溶液进样6针，以峰面积计算相对标准偏差。

 判断结果：定量限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应≤10%。

② 加校正因子的主成分自身对照法

采用加校正因子自身对照法应进行相应杂质的校正因子的测定，仅适用于已知杂质的控制，如果校正因子在0.2～5.0的范围内也可用加校正因子的主成分自身对照法。

 校正因子的定义及特点 一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。

 校正因子测定的要求 A 测定校正因子的各杂质与主成分的标准物质（对照品），应符合标准物质（对照品）的要求。B 确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定。C 要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。

 校正因子的测定：

 A 单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别进样测定，待测样品的绝对校正因子与参照样品绝对校正因子的比，得到校正因子。

 B 多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样测定，同法进行分别各点计算，求平均值，计算RSD，得到校正因子。

 C 标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值（峰面积等）进行线

性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。

 D 吸收系数比值法：对于UV检测器来讲，两物质的相对校正因子实际上也是两物质以流动相为溶剂，在检测波长处的紫外吸收系数E1cm1%之比，故可按吸收系数法测定法的相关技术要求测定各自吸收系数，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸收度介于0.3～0.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过±0.5%等。测定两物质的吸收系数后，经统计分析确定两物质吸收系数，计算比值，求得校正因子。

 测定方法的选择：上述各方法中，A和B法较为简捷，可以快捷地量化特定杂质与主成分紫外吸收特征的差异，多用于评估采用主成分自身对照法定量杂质时是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身对照法定量杂质，需将标准物质赋值信息转化为校正因子固化在质量标准中，那么校正因子的准确性非常关键，校正因子的准确计算应符合更为严格的要求，需要考虑并控制求算校正因子过程中的各种误差因素，以及仪器通用性和色谱系统的耐用性等因素，以便使求得的常数更为准确并具代表性，此时采用C、D法更为适宜，如能考虑到测定人员、不同试验室因素的影响，会更加符合常数求算的基本要求。

 在采用校正因子测定杂质的时候，要有加校正因子定量方式的合理性和测定结果的准确性的试验对比研究数据（研究数据应包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法对相同多批样品杂质定量测定结果的对比数据，作为是否需要校正或能否有效校正检测结果的支持与依据）。

③ 不加校正因子的主成分自身对照法（自身对照法）

 不加校正因子的主成分自身对照法（自身对照法）是杂质与主成分的响应因子基本

相同（校正因子在0.9～1.1）。一般情况下，如杂质与主成分的分子结构相似，其响应因子差别不会太大。

 测定方法：称取供试品样品适量，加适当溶剂配制成一定浓度的供试品溶液；精密量取供试品溶液稀释到一定浓度，一般1%或2%，作为对照溶液；量取供试品溶液中的杂质峰面积与对照溶液峰面积相比乘以稀释浓度即为供试品溶液中的杂质的含量。

④ 峰面积归一化法

峰面积归一化法测定有关物质简便快捷，但因各杂质与主成分响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素，所以在质量标准中一般不采用峰面积归一化法计算有关物质。

谢沐风的看法：

《仿制药研发中有关物质研究思路之我见 —— 暨如何科学客观地评价有关物质》 谢沐风

．归一化法的妙用 ICH 组织自 2000 年在有关物质检测中推出了自身对照法，旨在针对那些稀释 50~200倍后，主成分峰面积不呈线性的药物而言，因此时归一化测定结果有误。但此种情形在实际 检测中并不常见，仅为“小概率事件”。 笔者总结出主要有以下几种情形不呈线性：

(1)主成分为满足杂质检出限要求，在进样量 过大的情况下发生色谱柱或检测器超载；(2)主成分结构式较为怪异，如唑来膦酸，磷原子与 氧原子间形成双键结构，导致线性范

围很窄；

(3)梯度洗脱，此情形下色谱峰 已呈非正常性能，柱效高达上万也是此种表现。

(4) 供试品溶液浓度过低，导致 1.0%自身对 照已接近最小定量限

所以，建议研究者验证两法，如结果一致（绝对值差不超过 0.03%），可在质量标准中拟 定自身对照法，而对研发中的大量样品检测均采用归一化法[14]，从而做到活学活用、起到事半功倍之效能。目前，印度等一些制药公司在研发与制订质量标准时仍是均采用归一化法， 便如此。

．杂质校正因子测定法

关于杂质校正因子测定法，文献报道有单点法、三点法、多点法及标准曲线法等多种。 其实，采用最为简便易行的单点测定法即可：取杂质对照品与主成分对照品均配制 1.0%浓度， 连续进样 6 次，测得平均峰面积，计算校正因子；如此测得结果也必在误差范围内

关于校正因子的个人见解：

第一种：

目前我们校正因子项目做的是 做线性（包含定量限，和限度）和耐用性，耐用性平均值（排除个别偏差太大的数据，比如波长）作为最终的校正因子，精密度和准确度是不是就是考察方法的就可以？不知道如何操作。

第二种：

1：首先指导原则中的校正因子是相对重量校正因子，公式说话 F=C/A，这样的话，其实就是说对这个F进行全方位的验证；

2：按照1中的理解，进行一点个人解读，准确度：三个不同水平的F对比，看看差距有多大；

3：重复性：6个相似重量的样品计算出来的F值比较，然后2个人12个相似重量的样品计算出来的F值比较；

4：专属性：不同物质的F一般会不同，通过对比确认各个杂质的F；

5：定量限：这个应该是说在多少重量时，S/N刚好在10，所以我个人认为计算这个数据是为了给范围用的；

6：范围：药品的重量在什么范围内，做出来的标准曲线的斜率达标，一般会在LOQ~杂质限度150%；

7：耐用性：由于温度，流速，色谱柱都会不同程度的影响峰面积，进而影响F，所以必然要通过耐用性确认是否可以进 行一定范围内的温度，流速，色谱柱的变化。

第三种：

采用三根不同色谱柱，利用标准曲线法，测定各杂质的校正因子。

①在进行准确度时，会有一个外标法的回收率，此时的对照，应包含主成分，利用主成分进行加校正因子的回收率计算，即我们通常所做的几个方法（外标法、加校正因子、不加校正因子）回收率的比较，这就完成了准确度，实际上我们做验证时候就做了，只是没有单独罗列出来而已；

②重复性，不用想了，回收率重复性一起做，利用同一个对照，完成重复性试验，不过这里要提出的是，要用100%准确度溶液去进行校正因子的重复性试验，因为单纯样品不可能检出所有已知杂质。

③定量限、线性、范围、耐用性。同理，用100%准确度溶液＋对照去试验。我一般整套试验连续做完，不间断。校正因子的定量限就是利用主成分和校正因子的方法去换算。实际什么浓度你就乘上校正因子就是它的定量限了，其实没必要单独做，都包含在方法学里面了。

第四种：

校正因子是用于检测产品的杂质定量检测的，因此它的验证不是单一的校正因子的问题。它的验证项目基本和杂质定量的验证项目一致，其意义在于，如果现有一个有关物质的检测方法，该方法是已经经过验证的方法，你要做一个原来未做的杂质的校正因子，实际上杂质定量项目的验证你全部都要做。

再给你举个例子，一个药典上已有的有关物质分析方法，药典上已经有校正因子，但是如果我们用于检测，由于仪器等的差异，校正因子需要验证，这个时候你需要按照要求，定量限、线性等全部都要做，至于怎么做，你杂质定量的时候怎么做，这就怎么做，记得整个做的过程中都要把校正因子算进去，你应该知道是否乘校正因子，定量限是有差别的。

不要把校正因子和杂质定量割裂开看，有的时候确实是校正因子的验证，验证的时候就按照杂质定量的那种验证全部做就好了。