猪源a型产气荚膜梭菌β2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定

中国预防兽医学报

ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine

Vol.41，No.12Dec.2019

doi院10.3969/j.issn.1008-05.201905010猪源A型产气荚膜梭菌茁2毒素与

宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定

曾

秀1，张兰桥2，周

姣1，王婧祺1，戴益民1，张锦华

1*(1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045)摘要：产气荚膜梭菌产生的茁2毒素在仔猪肠炎中起着重要作用，为研究该毒素侵入宿主细胞的作用机

制，本研究以茁2为诱饵蛋白，将其与酿酒酵母转录因子GAL4的BD(DNAbindingdomain)融合表达，利用猪肠上皮细胞系IPEC-1的cDNA文库与GAL4的AD区(Activationdomain)融合表达，通过酵母双杂交系统筛选鉴定与茁2毒素相互作用的猪肠上皮细胞蛋白。筛选得到的阳性转化子经提取质粒和测序后，比对其所包含的编码蛋白序列，得到4个潜在的与茁2毒素存在相互作用的细胞蛋白，分别为S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。其中S20、L12和Atrophin-1是位于细胞内的核蛋白，而LGALS1是一种存在于细胞膜外侧的半乳糖凝集素，可能是毒素的作用位点。对LGALS1进行回交验证，结果显示其C端与茁2毒素的相互作用强于其完整蛋白与茁2毒素的相互作用。本研究结果对研究茁2毒素的致病机制奠定了基础。

关键词：茁2毒素；产气荚膜梭菌；IPEC-1；酵母双杂交系统；半乳糖凝集素(LGALS1)中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-05(2019)12-1204-06Identificationofhostproteinsinteractingwith

茁2toxin

ZENGXiu1,ZHANGLan-qiao2,ZHOUJiao1,WANGJing-qi1,DAIYi-min1,ZHANGJin-hua1*(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China;2.CollegeofBiologyScienceandEngineering,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China)Abstract:Beta2(茁2)toxinofplaysanimportantroleinpigletenteritis.Inordertostudythe

pathogenicmechanismsofthistoxin,yeasttwo-hybridtechnologywasusedinthisstudytoscreenandidentifyhostproteinsinteractingwith茁2toxin.Usedasabaitprotein,茁2wasfusedwithBDdomain(DNAbindingdomain)ofthe

transcriptionfactorGAL4forexpression.ThecDNAlibraryofporcineintestinalepithelialcelllineIPEC-1was

constructed,thenthecDNAlibrarywasfusedwithADdomainofGAL4forexpression.Theproteinsthatexistinthepigintestinalepithelialcellsandinteractwith茁2toxinwerescreenedandidentifiedbyyeasttwo-hybridsystem.Thepositiveyeasttransformantswereselected,andafterplasmidsextractionandsequencing,fourpotentialproteinsinteractingwith茁2toxinwereobtainedbycomparingthesequencesoftheencodedproteins,namelyS20,LGALS1,L12andAtrophin-1.Amongthese,S20,L12andAtrophin-1areintracellularnucleoproteins,whileLGALS1isonekindofgalectinsthatarelocatedinthecelloutermembraneandmayberelatedtotheinvasionoftoxins.Therefore,LGALS1wasverifiedbyyeastretestanalysis.TheresultsshowedthattheinteractionbetweenC-terminaland茁2toxinisstrongerthanthatofthefull-lengthprotein.Theresultsofthisexperimentwillplayanimportantroleinelucidatingthepathogenesisof茁2toxin.

Keywords:beta2toxin;*Correspondingauthor

收稿日期：2019-05-06

基金项目：国家自然科学基金(31860694、31660720)

作者简介：曾秀(1995-)，女，江西上饶人，硕士研究生，主要从事动物肠道微生物和兽医公共卫生研究.*通信作者：E-mail：zhangjh1122@jxau.edu.cn;IPEC-1;yeasttwo-hybridsystem;LGALS1

第12期曾秀，等.猪源A型产气荚膜梭菌茁2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定1205

产气荚膜梭菌(，Cp)，在自然界广泛分布，是革兰氏阳性产芽孢粗大杆菌。Cp是引起人类食物中毒、多种动物坏死性肠炎、肠毒血症的重要病原微生物之一[1]。对幼年动物影响较大，被感染的幼畜即使经治疗存活下来，也会出现发育迟缓的现象[2]，对动物的生产性能以及畜牧业的发展造成了重大的经济损失。根据其主要的4种致死性毒素[2](琢、茁、着、咨)，Cp可分为A、B、C、D、E5种类型，除此之外最新的分类还依据肠毒素(CPE)和坏死性肠炎毒素B(NetB)增加了F和G型[3]，其中A型和C型Cp是导致动物发病的主要病原。Cp还产生茁2、兹等其它外毒素和侵袭性酶，达16种以上。其中茁2毒素是一种具有细胞毒性和致死性的强毒素[4-5]，其由CPB2基因编码产生，可以由所有型Cp产生[6]，目前CpA的茁2毒素研究较多。有研究表明茁2毒素可能是琢毒素的辅助毒素，茁2毒素和琢毒素具有协同作用[7]；也有研究表明茁2毒素具有细胞毒性，可以引起豚鼠胃肠道出血坏死[4]；茁2毒素在体外试验中表现出对人Caco-2细胞的毒性作用[6]。但是茁2毒素的致病机制还不明确，其对细胞的毒性作用存在较大的争议，且目前尚未见到与茁2毒素相互作用的宿主蛋白的研究报道。因此，本研究首次采用酵母双杂交技术，以CpA(JXJA17菌株)的茁2毒素为“诱饵”蛋白，从猪肠上皮细胞系(IPEC-1)的cDNA文库中筛选到4个与茁2毒素相互作用的宿主蛋白。其中半乳糖凝集素-1(LGALS1)存在于细胞膜外侧，具有调节细胞生长、细胞黏附、诱导细胞凋亡等作用[7-8]。酵母回交验证试验进一步证实茁2毒素和LGALS1存在特异相互作用，为进一步探究茁2毒素侵入细胞机制提供实验依据。1

材料与方法

1.1主要实验材料CPJXJA17菌株(CP028149.1)

由本实验室分离鉴定并保存；IPEC-1酵母双杂交文库由江西农业大学生命科学与工程学院教研室惠赠；质粒pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pG-BKT7-Lam、pGBKT7-53、酵母菌株Y2HGold均购自Clontech公司；PrimeSTARRHSDNA聚合酶、性内切酶RⅠ、HⅠ、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；蛋白Marker购自Genview公司；MatchmakerTMGold酵母双杂交系统购自Clon-tech公司；带c-Myc标签的小鼠单克隆抗体(MAb)、山羊抗小鼠IgG-HRP均购自Sigma公司；化学发光(ECL)试剂盒购自美国Amersham公司。1.2JXJA17菌株茁2毒素基因的PCR扩增根据Cp茁2毒素基因序列(AJ537530.1)，设计扩增该基因(798bp)的引物(表1)，使用细菌基因组提取试剂盒按照说明书提取JXJA17菌株(CP028149.1)的DNA，以其为模板，以引物BD-茁2-F/和BD-茁2-R(表1)PCR扩增JXJA17菌株中的茁2毒素基因，PCR产物回收纯化后连接至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-茁2，重组质粒经测序鉴定后备用。表1

实验所用引物

引物Primers序列Sequences(5'→3')BD-茁2-FCCGGAATTCATGAAAAAAATTATTTCABD-茁2-RCGCGGATCCCTATGCACAATACCCTAD-LGALS1-FGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCTTGTGGTCTGGTCAD-LGALS1-RACGATTCATCTGCAGCTCGAGCTCAAAGGCCACACACTTGAD-LGALS1-C-FCCGGAATTCGGCTGGGGGGCCGAGCAGAD-LGALS1-C-RGCGGGATCCAGGGGCAGCAAAGGCAAT1.3诱饵质粒pGBKT7-茁2的构建与鉴定质粒pMD18-茁2经RⅠ/

HⅠ双酶切后胶回收茁2毒素基因，连接至质粒pGBKT7中构建重组表达质粒pGBKT7-茁2，转化Top10感受态细胞，挑选阳性转化子扩大培养，并提取质粒pGBKT7-茁2经RⅠ/HⅠ双酶切鉴定后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。1.4含茁2毒素基因诱饵蛋白的表达与鉴定使用LiAc法制备酵母菌Y2HGold感受态细胞，将测序正确的质粒pGBKT7-茁2转化至Y2HGold中，同时设pGBKT7转化至Y2HGold中为阴性对照，菌液涂布SD/-Trp固体平板培养基，30℃培养3d～5d，挑取阳性克隆提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将测序结果正确的pGBKT7-茁2/Y2HGold菌株培养至10mLSD/-Trp液体培养基中，30℃培养3d，经5000r/min离心2min收集细菌；用0.2mol/LNaOH抽提酵母细胞的总蛋白，经10%SDS-PAGE电泳、转膜，用5%脱脂乳室温封闭1h，以带cMyc标签的小鼠MAb(1颐5000)为一抗4℃过夜孵育，羊抗鼠IgG-HRP(1颐5000)为二抗，同时以pG-BKT7/Y2HGold为空白对照，经westernblot检测茁2毒素基因诱饵蛋白的表达。1206中国预防兽医学报2019年

1.5诱饵蛋白茁2毒素的毒性及自激活鉴定将质粒pGBKT7-53和pGADT7-T共转化酵母感受态细胞作为阳性对照；将质粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共转化酵母感受态细胞作为阴性对照组；以诱饵质粒pGBKT7-茁2与pGADT7共转化酵母感受态细胞作为实验组，分别取每种转化重组菌液100滋L各涂布于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板，30℃培养3d～5d，观察结果。1.6筛选与茁2毒素相互作用的宿主蛋白将pG-BKT7-茁2/Y2HGold重组酵母菌培养至OD600nm=0.8时，离心弃上清，用5mLSD/-Trp液体培养基重悬沉淀，加入1mLIPEC-1cDNA文库混合，同时加入含有卡那霉素(浓度为0.1mg/mL)的2伊YPDA液体培养基45mL，于30℃低速培养20h以上，在显微镜下观察细胞形态。当大部分细胞呈现“米老鼠头”时，离心弃上清，用YPDA液体培养基重悬菌体，离心弃上清，用10mL0.5伊YPDA液体培养基重悬沉淀，并涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上，30℃倒置培养3d～5d进行初筛。将初筛获得的阳性菌落重新涂布至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His再次筛选，将复筛长势良好的转化子接种至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His液体培养基中，培养3d～8d后提取酵母质粒，并将酵母质粒转化至Top10感受态细胞中提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，对测序结果经NCBI数据库进行BLAST比对分析。1.7质粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C的构建根据上述筛选并经NCBI比对得到的与茁序2列毒设素计引相互物作(用表的1)LGALS1，以IPEC-1蛋白的基因cDNA的全文长库核苷为酸模板，使用引物AD-LGALS1-F/AD-LGALS1-RPCR扩增LGALS1基因的全长；使用引物AD-LGALS1-C-F/AD-LGALS1-C-RPCR扩增LGALS1基因的C端序列。反应程序均为98℃10min；98℃30s、58℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。反应结束后，PCR产物经胶回收纯化后分别连接至pGADT7载体，构建重组质粒pGADT7-LGALS1、pGADT7-LGALS1-C，转化Top10感受态细胞中，挑选阳性克隆子经PCR鉴定后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，鉴定正确的提取质粒pGADT7-LGALS1和质粒pGADT7-LGALS1-C备用。1.8LGALS1与β2毒素相互作用的回交试验将重组质粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C分别转化至1.4得到的pGBKT7-茁2/Y2HGold重组酵母菌中，并以pGADT7-T+pGBKT7-P53转化该重组菌作为阳性对照，分别以pGADT7-T+pGBKT7-Lam转化该重组菌以及以pGADT7-T+pGBKT7-茁2转化该重组菌作为阴性对照。分别接种至SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His液体培养基中30℃培养3d，将培养后的菌液10倍倍比稀释(100～104)后分别取10滋L各转化重组菌的SD/-Leu/-Trp菌液依次点在SD/-Leu/-Trp平板上；分别取10滋L上述经稀释的各转化重组菌的SD/-Leu/-Trp/-His菌液依次点在SD/-Leu/-Trp/-His平板上，于30℃培养3d～5d，观察酵母菌的生长情况。2

结果

2.1诱饵质粒pGBKT7-茁2的鉴定结果以JX-

JA17菌株的DNA为模板，PCR扩增结果显示，扩增得到了约800bp的目的条带，与预期大小一致(图1)。测序结果显示扩增的茁2毒素基因无碱基发生突变。诱饵质粒pGBKT7-茁2经RⅠ和HⅠ酶切鉴定，结果显示pGBKT7-茁2经双酶切后在798dp处有目的条带(图2)，测序结果显示茁2毒素基因无碱基突变。M121000bp750bp798bp500bpM:DL2000DNAMarker;1-2:茁2toxingene图1茁2毒素的PCR扩增结果

2.2茁2毒素蛋白的表达鉴定将质粒pGBKT7-茁2

转化至酵母菌株Y2HGold内，涂布SD/-Trp固体平板培养基后，挑取转化子提取质粒并测序鉴定，结果显示pGBKT7-茁2/Y2HGold中含有质粒pGBKT7-茁Y2H2，且Gold茁2可基因用于未后发生续的碱基试突变验。，采表用明westernpGBKT7-blot茁检2/测茁2毒素基因的表达情况。结果显示，pGBKT7-茁而2/Y2HpGBKT7/Y2HGold重组Gold菌可未见见约该48蛋ku白的目条带的(图蛋白3)，条表带明，茁2毒素在酵母菌中能正确表达，满足后续试验的需第12期曾秀，等.猪源A型产气荚膜梭菌茁2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定1207

要。M15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp12M固体培养基上生长，且菌落大小和数量基本一致(图4A)，表明诱饵蛋白茁2毒素的表达对酵母菌无毒性。在SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上仅阳性对照15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp能生长(图4B)，表明诱饵蛋白茁2无自激活活性。2.4与茁2毒素互作蛋白的筛选及序列分析将pGBKT7-茁2/Y2HGold和IPEC-1cDNA文库融合得到的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上培养，挑选长出的菌落接种至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His固体培养基，培养后，共获得了18个阳性克隆菌株。将得到的18个阳性克隆菌株分别提取质粒，转化Top10感受态细胞并提取质粒测序，测序结果经NCBI数据库比对，得到4种能与茁2毒素蛋白相互作用的IPEC基因，这4种基因序列分别编码蛋白S20、LGALS1、L12和Atrophin-1(表2)。SD/-Leu/-TrpABSD/-Leu/-Trp/-His1000bp1000bp798bpM:DL15000DNAMarker;1:pGBKT7-茁2;2:DoubleenzymedigestronofpGBKT7-茁2plasmids图2质粒pGBKT7-茁2双酶切鉴定结果

1248ku1:pGBKT7/Y2HGold;2:pGBKT7-茁2/Y2HGold图3茁2毒素诱饵蛋白表达的检测结果

C2.3诱饵蛋白茁2毒素的毒性和自激活鉴定结果分别将质粒pGBKT7-53和pGADT7-T共转化酵母感受态细胞作为阳性对照；将质粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共转化酵母感受态细胞作为阴性对照；以诱饵质粒pGBKT7-茁2与pGADT7共转化酵母感受态细胞作为试验组，并分别将各重组菌接种在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上(图4C)，培养后观察可见3种菌均能够在SD/-Leu/-Trp

表2

基因登录号

GeneaccessionnumberAAS55928.1AK394553.1AAS55903.1XP_025221020蛋白ProteinS20LGALS1L12Atrophin-1图4BD-Lam+AD-TBD-茁2+AD-TBD-P53+AD-T重组菌划线分区示意图Theschematicdiagramofscribedpartitionfortherecombinantyeasts诱饵蛋白茁2的毒性(A)和自激活(B)检测结果

与茁2毒素蛋白相互作用的细胞蛋白基因测序分析结果

蛋白描述Proteindescription40SribosomalproteinS20Lectin,Galectin-160SribosomalproteinL12CDK5andABL1enzymesubstrate1isoformX3功能分析Functionalanalysis蛋白合成

Proteinsynthesis增殖分化

Regulationofproliferationanddifferentiation蛋白合成

Proteinsynthesis蛋白合成

Proteinsynthesis2.5质粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-以IPEC-1的cDNA文库为模板，采用不列。结果显示，分别扩增得到了约400bp和250bp的目的条带，与预期大小一致(图5)。分别将其与质粒pGADT7连接转化后测序，结果显示扩增产物分C的构建同的引物分别扩增LGALS1基因的全长及其C端序1208中国预防兽医学报2019年

别与LGALS1基因的全长及其C端序列完全一致，表明质粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C构建正确。M1M231000bp700bp1000bp500bp700bp400bp408bp500bp300bp400bp200bp300bp200bp250bp100bp100bpM：DL1000DNAMarker；1：完整LGALS1基因的PCR产物；

2～3：LGALS1C端基因的PCR产物

M:DL1000DNAMarker;1:PCRproductsofcompleteLGALS1gene;2-3:PCRproductsofLGALS1C-terminalgene图5LGALS1基因的PCR扩增结果

2.6茁2毒素与LGALS1全长及其C端相互作用的回交试验结果将pGBKT7-53和pGADT7-T共转化酵母菌作为阳性对照，其在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板上均能生长，并且随着菌液浓度的降低，其生长的数量减少；而pGADT7-T和pGBKT7-Lam共转化酵母菌与pGADT7-T和pG-BKT7-茁2共转化酵母菌作为阴性对照，其在SD/-Leu/-Trp平板上能生长，且随着重组菌的浓度降低，其在SD/-Leu/-Trp平板上生长的数量减少；同时这两组阴性对照在SD/-Leu/-Trp/-His平板上几乎不生长。pGADT7-LGALS1和pGBKT7-茁2共转化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能够正常生长，但随着重组菌的菌液浓度不断降低，其生长的数量越来越少；该转化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能够生长，但随着菌液浓度的降低，其生长数量减少，且在菌液稀释10倍之后就不再生长。表明茁2毒素和LGALS1蛋白存在相互作用，但作用强度较弱。pGADT7-LGALS1-C和pGBKT7-茁2共转化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能够正常生长，但随着重组菌的菌液浓度不断降低，其生长的数量越来越少。该转化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能够生长，随着菌液浓度的降低，其在SD/-Leu/-Trp/-His平板上生长的数量减少，在菌液稀释103倍后就不再生长，表明茁2毒素与LGALS1蛋白C端能够发生较强的相互作用(图6)。上述结果表明茁2毒素与LGALS1

蛋白在酵母细胞中存在相互作用，但茁2毒素与LGALS1蛋白C端的作用比其与LGALS1完整蛋白的作用更强。100101102103104pGADT7-LGALS1+pGBKT7-茁2pGADT7-LGALS1-C+pGBKT7-茁2pGADT7-T+pGBKT7-茁2pGADT7-T+pGBKT7-P53pGADT7-T+pGBKT7-LamSD/-Leu/-Trp100101102103104pGADT7-LGALS1+pGBKT7-茁2pGADT7-LGALS1-C+pGBKT7-茁2pGADT7-T+pGBKT7-茁2pGADT7-T+pGBKT7-P53pGADT7-T+pGBKT7-LamSD/-Leu/-Trp/-His图6茁2毒素与LGALS1相互作用的回交试验结果

3讨论

酵母双杂交技术是鉴定蛋白质互作最有效和最广泛的分子生物学技术[9]，其具有操作简单、成本低、高效、敏感度高、应用范围广等优点。目前，酵母双杂交技术也被用来探究与已知蛋白(Pik-h蛋白、刚地弓形虫14-3-3蛋白等)相互作用的蛋白[9-10]。然而，目前未见有将酵母双杂交技术应用到筛选与Cp茁2毒素相互作用的蛋白中，本研究首次将酵母双杂交技术应用到筛选与Cp茁2毒素互作的宿主蛋白。Cp是一种存在于肠道内的条件性致病菌，会造成仔猪的腹泻、坏死性肠炎以及猝死等症状[3]，该菌产生的茁2毒素对小肠粘膜上皮细胞的作用机制还不明确[5]，本研究构建了Cp茁2毒素的重组表达质粒pGBKT7-茁2，将其转化至Y2HGold后能正常表达茁2毒素蛋白，且无自激活和自毒性作用。将其作为“诱饵”蛋白，通过酵母双杂交技术从IPEC-1的cDNA文库中筛选出与茁2毒素相互作用的4种蛋白：S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。S20、L12和Atrophin-1属于核蛋白，其它蛋白的合成[11-13]，而LGALS1蛋白与细胞的粘附、增殖第12期曾秀，等.猪源A型产气荚膜梭菌茁2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定1209

和凋亡有关[7]，具有进一步的研究价值。LGALS1回交试验证实了LGALS1蛋白与茁2毒素具有特异性的相互作用，但两者之间相互作用强度较弱。有研究表明LGALS1是一种位于细胞膜中的蛋白，推测茁择2LGALS1毒素与其的作蛋白用强度C端与可茁2能与毒素其进结行构相有互关作，因用此的选验证。结果显示茁2毒素与LGALS1蛋白C端的作用强于其与LGALS1完整蛋白的作用。本实验所用的C端是从LGALS1蛋白C末端开始的66个氨基酸，其结构中含有6个片层和一个环状结构，包含糖结合识别域(CRD)的大部分结构，与完整蛋白相比该区域可能增加了茁2毒素与其作用位点结合的概率，且重组表达的蛋白结构与原蛋白结构可能略有些差异，其具体的作用位点还需要进一步验证。LGALS1蛋白(半乳糖凝集素1)又称为Galectin-1，由LGALS1基因编码，是哺乳动物凝集素的一种，是最先被报道的一种内源糖结合蛋白，参与多种病理、免疫过程，具有促进肿瘤的转化、参与细胞粘附、调节细胞生长、促进细胞凋亡、炎症反应发生、免疫调节等作用[7-8]

，并且LGALS1蛋白还是NDV(新城疫病毒)HN蛋白以及VSV(水泡性口炎病毒)G蛋白的受体[14-16]，在这些病毒感染的过程中LGALS1的含量会上升，但是还未有研究表明其为细菌毒素的受体。本次研究也为研究LGALS1蛋白的功能作用提供了新的方向。本研究采用酵母双杂交技术筛选并鉴定出与Cp茁过2C毒端素与相互茁2作毒用素的结蛋白质合，从LGALS1而调节细，该胞蛋白的炎主要通性因子和细胞凋亡。本研究首次将酵母双杂交技术应用到筛选与茁2毒素互作的宿主蛋白中，为茁2毒素的研究提供了新方法，并为进一步研究其细胞毒性和致病机理奠定了基础。参考文献：

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