日本结缕草衰老叶片全长cdna文库构建及酵母单杂交筛选验证

Vol27 No'6

草地学报

ACTA AGRESTIA SINICA

2019年 11月Nov' 2019doi：10. 11733\". issn. 1007-0435. 2019. 06. 004日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单

杂交筛选验证滕 珂】，檀鹏辉2,范希峰】，岳跃森】，姜红岩2,武菊英“(1.北京市农林科学院，北京草业与环境研究发展中心，北京100097； 2.北京林业大学，草业与草原学院,北京100083)摘要：脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH)是叶绿素降解过程中的一个关键

酶,目前有关日本结缕草Ooyia japomca/PH基因的上游调控机制仍不是十分清楚，筛选日本结缕草ZjPPH1

基因上游转录因子可以为延长绿期延缓衰老提供理论依据(本研究利用Clontech的SMRT cDNA合成技术构建

一个日本结缕草衰老叶片的高质量全长cDNA文库，其滴度为2.0X106 cfu - mL 1 ,插入片段平均长度大于1 kb, cDNA片段插入重组率为100%(该文库的完整性较高，可涵盖绝大多数基因信息，为酵母单杂交筛选奠定了基

础(利用酵母单杂交技术，筛选到可与Z/PH1基因启动子片段结合的候选菌落42个，并对20个候选基因进行

测序和生物信息学分析，初步筛选到6个参与细胞生长和衰老过程的重要候选基因，为进一步探索Z/PH1基因 在日本结缕草衰老和叶绿素降解中的上游调控机制提供了理论支撑(

关键词：日本结缕草；全长cDNA文库；酵母单杂交;脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶基因

中图分类号：S543.9

文献标识码：A 文章编号= 1007-0435(2019)111486-08Generating of a Full Length cDNA Library Using Senescence Leaves of

Zoysia japonica and Yeatt One-hybrid Screening ValidationTENG Ke1 , TAN Peng-hi , FAN Xi-feng1 , YUE Yue-sen1 , JIANG Hong-yan2 , WU Ju-yingr*

(1'Bei.ingResearchandDevelopmentCenterforGrassandEnvironment Bei.ing AcademyofAgricultureandForestry

Sciences , Beijing 100097 , China； 2. College of Grassland Science , Beijing Forestry Universty , Beijing 100083 , China)Abstract：Heophytinpheophorbidehydrolase (PPH)isakeyenzymeinchlorophyldegradation'Current-

ly,the upstream regulating mechanism of ZjPPH1 has not been well illustrated in Zoysia japonica. Screen7ngtheupstreamtranscr7ptonfactorsofZoy1iajaponicaZjPPH1genew7lprov7detheoretcalba- sis for prolonging its green period and delaying senescence. In this study,a high quality full length cDNA ibraryof Zoy1iajaponica senescence&eaves wasconstructed using SMRT cDNA synthesis method of C&onetchcompany.Itstiterwas2.0X106cfu.mL—1.Theaverage&engthoftheinsertsegmentswasmore than 1 kb,and the recombination rate was 100%. This cDNA library could cover the most transcriptional informaRionandprovidequalified maRerialforfurRheryeasRone-hybridscreening.Wefound42candidaRe

clones which could be inReracRed wi hRhe promoRer segmenRof ZjPPH1Rhrough yeasRone-hybrid screen- ing.Then20cloneswereselecRedRobesequencedandanalyzedusingbio-informaRics meRhods.6impor- RanRcandidaRegenesinvolvedincelgrowRhandsenescenceprocesseswerescreenediniialy.ThissRudy pavesRhe wayRo furRher invesRigaReRhe upsRream regulaRing mechanism of ZjPPH1 in senescence proces- sesandchlorophyldegradaRionofZoy1iajaponica.Key words：Zoy^za japonica ;Full length cDNA library; Yeast one-hybrid screening；PPH植物cDNA文库是植物在特定发育时期或特 的cDNA片段与文库载体连接而成的克隆的集合+1,(自从1976年HOFSTETTER构建了首个定生长条件下转录的全部mRNA经过反转录而成

收稿日期：2019-06-26;修回日期：2019-08-21基金项目：国家自然科学青年基金(31901397)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX2018010120180706)；北京市科技计划项

目(No. 171100007217001)资助作者简介：滕珂(1989-),男，汉族，山东淄博人，助理研究员，研究方向为草坪草分子生物学,E-mail :tengke. 123@163. com；\"通信作者

Authorforcorrespondence&E-mail：wujuying!grass-env com第6 期滕珂等：日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证1487cDNA文库以来,cDNA文库的应用越发广泛，构建 结缕草的叶绿素降解和衰老途径提供理论依据。技术亦经历了多次升级经典cDNA文库受到 克隆片段长度的限制，存在一定的天然缺陷［1\\全

1材料与方法1.1材料研究所用的植物材料为日本结缕草'Ueyer，品种, 其幼苗放置于人工气候箱（RXZ-380D-LED,宁波江南 仪器）中培养。培养条件为28°C/25°C （昼/夜），湿度

65%,光照 16 h - d—1，光强 600 %mol - m—2 • s—1，种植

长cDNA文库可提供完整的mRNA信息，并且可 以用来研究mRNA可变性剪切信息均一化

cDNA文库，可增加获取低丰度mRNA的概率4。

构建cDNA文库不仅可以保存濒危物种的基因资

源，也可以用于批量克隆基因而进行基因功能研 究近年来，随着分子生物学的不断发展，对基因

上下游调控机制的研究已越发受到青睐。因此，获

得一个高质量的cDNA文库成为深入研究基因功 能及其调控机制的重要基础。酵母单杂交系统是在酵母双杂交基础上衍生而

来的，主要用来研究DNA与蛋白质的互作56。酵 母单杂交的主要原理基于DNA结合域与转录激活

域相互独立，将猎物蛋白融合到含有GAL4转录激

活域的载体中，然后用诱饵序列调取猎物蛋白激活 下游报告基因，从而达到筛选或验证的目的⑺。酵 母单杂交系统的优点在于借助酵母体内表达，保证

转录因子蛋白的自然结构，可更真实的模拟真核蛋 白的表达模式8。目前，应用较为广泛的酵母单杂 交系统主要有PHIS2系统和pAbAi系统；前者不

需要对表达载体进行线性化进而整合到酵母基因 组，具有操作方便的优点，而后者采用金担子素A

（Aureobasidin A，AbA）作为筛选标记，具有灵敏度

高的优点。但是,单纯的酵母单杂交筛选无法完全避 免假阳性的存在,需要结合双荧光素酶（Dual-lucifer-

ase）分析和凝胶迁移（Electrophoretic mobility shift

assays, EUSA）等手段进一步验证互作的真实性。日本结缕草（Zoyiia japonica）是一种重要的暖 季型草坪草，因其耐践踏、抗旱性强、耐盐等优点而 广泛应用于运动场草坪的建植及城市绿化。然

而，较短的绿期成为制约结缕草在我国北方地区进 一步推广应用的重要因素［1213］。因此，从分子水平 上揭示日本结缕草叶绿素降解的调控机制显得十分

必要，可为延长绿期和延缓衰老提供理论依据。脱

镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶（Pheophytin pheo-

phorbide hydrolase,PPH）专一地催化脱镁叶绿素a

脱植醇生成脱镁叶绿酸a,是调控叶绿素降解的一 个关键酶。但目前，有关PPH的上游调控机制 仍不是十分清楚，在结缕草上更是如此。本研究旨 在构建一个高 质量 的 日 本结缕 草 衰老 叶片 的 全 长

cDNA文库,并利用酵母单杂交技术筛选ZjPPHl

基因的上游调控转录因子，以期为更好地探索日本

基质为草炭,蛭石和珍珠岩（2 ： 1 ： 1）混合基质，培养8 个月。RNA提取试剂盒购于OUEGA公司（美国）

cDNA构建试剂盒、亮氨酸缺陷型培养基（SD/- Leu）、色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp）、亮氨酸-色

氨酸缺陷型培养基（SD/-Leu-Trp）,色氨酸-组氨酸 缺陷型培养基（SD/-Trp-His）、亮氨酸-色氨酸-组氨

酸缺陷型培养基（SD/-Leu-Trp-His）等这些酵母缺

陷型培养基购自Clontech公司（美国）感受态细 胞HST08、限制性内切酶Sfi I购于TaKaRa公司

（日本）酵母单杂交系统为BD公司（美国）

（www . bdbiosciences. com）的 pHIS2 系统,3-AT

（3-AUINO-l, 2, 4-TRIAZOLE ）购自 Sigma-

Aldrich公司（德国）（所用的电转仪为BIO-RAD

公司（美国）的E. coii pulser。1.2方法1.2.1 总RNA的提取及全长cDNA的合成 选

取健康生长的日本结缕草自然衰老的叶片，称取

0.1 g,液氮中全部研磨，用试剂盒提取总RNA,得 到的 RNA 用 DNaseI 处理（用 Nano Drop 2000C

分析提取的RNA的OD 260/280和OD 260/230的 比值,之后经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,检

测合格的RNA用于后续试验。首先，取1%gRNA 使用 Clontech 公司的 SUART cDNA Library Con­

struction Kit合成第一链cDNA；然后利用Advan- tage HF 2 PCR Kit （Clontech 公司）取 2 %L 第一链

cDNA进行LD-PCR扩增,合成双链cDNA。反应结

束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测cDNA合成效果。1.2.2 cDNA短片段去除使用限制性内切酶

Sfi I对cDNA进行酶切处理，然后使用CHROUA

SPIN-1000-TE对酶切后cDNA进行过柱处理，去

除短片段。经PCI/CI净化处理后，用无水乙醇精 制，最后用dd HZO溶出。取1%LcDNA进行琼脂 糖凝胶电泳检测短片段去除效果。1488草地学报第 27 卷1.2.3 初级文库质粒的获得 使用DNA ligation

Kit将pGADT7载体与适量过柱后的cDNA在12C

Leu-Trp的培养基上，以此监控转化效率。剩下 500 %L 酵母感受态涂 布 于 10 个 含 有 最 适 3:AT 的 SD/-Leu-Trp-His培养基平板上，30°C下培养48 ho

条件下过夜连接，将获得的连接液进行纯化精制，得 到20 %L初级cDNA文库。取0.5 %L初级文库连接

挑取能够正常生长的酵母单菌落，分别划线至新的 含有适量3-AT的SD/-Leu-Trp-His培养基上，能

液，利用BIO-RAD公司的E. coii pulser电转仪转化

HST08感受态细胞(电转条件为！. 8 KV,200 *,25

%够正常生长的即视为互作蛋白。最后，利用通用引

F)。取10 %L转化液涂布氨苄(Ampicillin, Amp)抗 物pGADT7-F和pGADT7-R进行菌落PCR，经测 序后确定候选基因。性的LB平板,37C过夜培养，统计平板生长菌落的个

数,按照文库滴度(cfu・mL-1)=单菌落数量X稀释 1.2.6候选基因的生物信息学分析利用DNA-

倍数/涂板体积(mL)公式计算初级文库的滴度。随

机挑取16个单菌落,使用通用引物pGADT7-F (5-

GGAGTACCCATACGACGTACC -3Z)和 pGADT7-R (5-TATCTACGATTCArCTGCAGC 3)进行插入片

段检测。1. 2. 4 初级cDNA文库百万级扩增及质粒提取根据初级文库的库容大小，取初级文库大于

100万克隆的量，计算需要的连接液的体积，电转化

至HST08感受态细胞中，涂布10个Amp抗性的

LB大平板(24. 5 cmX24. 5 cm),37°C过夜培养，监

测实际转化获得的扩增克隆数量。回收扩增菌落,

用 Nucleo Bond Xtra Midi EF 试剂盒(Clontech 公

司)进行质粒提取，取100 ng扩增文库质粒进行1.

5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.5 酵母单杂交筛选cDNA文库 将前期试验

克隆得到的ZjPPHl基因启动子的327 bp的序列通 过同源重组的方法克隆到PHIS2载体中，获得

pHIS2 -ZjPPHlpro重组载体。为确定能够抑制HS3

表达背景的最低3-AT浓度，首先将pHIS2-ZjP-

PHlpro质粒通过LiAc的方法转化Y187酵母感

受态细胞，之后用0. 9%的NaCl溶液将鉴定为阳性

克隆的菌液OD值调到0. 2左右,然后取10 %L菌液 稀释1,10,100倍，分别点在含有0,50,60,80,100,

150 mmol ・ L—13-AT 的 SD/-Trp-His 平板上，30°C下

培养48 ho监测酵母的生长情况，然后确定最低

3 - AT的浓度。在确定好3-AT浓度之后，利用共转化的方法

进行酵母单杂交筛选。试验设置正对照为:pGAD-

Rec2-53 + p53HIS2 ；负 对照为：pGAD-Rec2-53 +

pHIS2。取 10 %LcDNA 文库质粒(1 %g ・ %L—1 )和 5 %g pHIS2-ZjPPHlpro 质粒，共转化 600 %L 的 Y187酵母感受态细胞。用0.9%的NaCl溶液将转

化后的Y187酵母感受态细胞稀释到OD值约0. 2O 分别取100 %L 1/10、1/100和1/1000转化后的酵 母感受态细胞涂布于SD/-Leu,SD/-Trp和SD/-

MAN 8. 0对PCR测序结果进行去载体片段处理,

确定候选蛋白核苷酸序列。确定序列之后，制作

FASTA格式文件,利用百迈客的云平台小工具(h--

tps！//console.biocloud.net ) 进 行 Nr ( NCBInon:redundantprotein database)&KEGG ( Kyotoency:clopedia of genes and genomes) ,Cog(Cluster of or-

thologousgenes)&SwissProt (A manualyannota:ted&non:redundant protein database )&Kog (eu:Karyotic orthologous groups)等注释，获得候选基

因的生物信息学信息。2结果与分析2.1 RNA提取及质量检测利用Nano Drop 2000C检测RNA的质量和浓 度，结果显示 OD260/280 = 2. 07, OD260/230 =2. 13,RNA质量合格。经1.5%琼脂糖凝胶电泳再次检测RNA的质量，结果显示，18S和28S两条带 清晰可见(图1),RNA质量可满足建库要求。Marker Total RNA28s rRNA18s rRNA图1 RNA质量检测Fig 1 jualityverificationoftheRNA2. 2 全长cDNA合成取5 %L cDNA进行1. 5% 琼脂糖电泳检测合 成效果 。 结 果 显 示 &获 得 的 cDNA 长 度 分 布 在 250

第 6 期滕 珂等：日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证1489〜4 500 bp区间内（图2）,表明已获得质量合格的 等得到有效去除，可用于下一步的连接转化（图3）oMarker cDNAcDNA,可用于下一步试验。Marker cDNA4 500 bp3 000 bp2 250 bp1 500 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp4 500 bp3 000 bp2 250 bp1 500 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp图3短片段去除检测图2 全长ds cDNA检测Fig 2 QualityexaminationofthefullengthdscDNAFig. 3 Purifying of the ds cDNA2. 4载体连接及初级文库滴度检测经计算，该研究所获cDNA初级文库的库容约

2.0X106 cfu・mL—1。随机挑取16个单克隆，利用

2.3短片段去除用Sfi I对上一步所获得的cDNA进行酶切处理

后，利用CHROUA SPIN-1000-TE进行过柱处理，去 除短片段。经PCI/CI净化处理后，取1 %LcDNA

引物pGADT7-F和pGADT7-R进行菌落PCR检 测。电泳结果显示，插入片段的长度分布范围为

500〜3 000 bp,平均长度大于1 000 bp。16个克隆

进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳。结果显示，小于500

bp的小cDNA片段和未使用完的引物、引物二聚体Marker 1

均可扩增出高亮条带，重组率为100%（图4）o78

2 3 4 5 69 10 11 12 13 14 15 16 Marker3000 bp-------1000 bp图4插入片段检测Fig 4 DeterminationoftheinsertedcDNAsegments注：1〜16表示不同插入片段Note：1 〜16representingdiferentinsertsegments2.5初级cDNA文库百万级扩增及质粒提取取初级文库约130万克隆的量电转化HST08 感受态细胞，涂布10个24. 5 cmX24. 5 cm的LB 平板，7°C过夜培养检测实际转化获得的扩增克隆

2. 6 pHIS2-ZjPPHlpro质粒最低3-AT浓度筛选为确定能够抑制HS 表达背景的最低3-AT 浓度，首先将pHIS2-ZjPPHlpro质粒通过LiAc的

方法转化Y187酵母感受态细胞。用0.9%的NaCl 水溶液将确定为阳性克隆的菌液OD调至0. 2左

数量。回收扩增菌落，使用NucleoBond Xtra Midi

EF试剂盒进行质粒提取后，共获得扩增文库质粒约 5mg。取100 ng扩增文库质粒进行1. 5%琼脂糖

右，然后取10 %L梯度稀释，分别点在含有0,50, 60 ，80 ，100 ，150 mmol ・ L—1 3-AT 的 SD/-Trp-His 的平板上。30C培养48 h后的结果如图6所示，在 低浓度3-AT背景下，均发现有不同程度的酵母克

凝胶电泳，结果显示，文库质粒大小符合预期（图

5）（该研究获得扩增文库质粒充足，可满足后续酵

母单杂交等试验需求。隆生长；而在150 mmol・L—1的3-AT背景下，酵母

1490草地学报第 27 卷生长明显受到抑制，表明150 mmol・L—1的3-AT浓 度可以有效抑制背景HIS3的表达，该浓度可用于 下一步的酵母单杂交筛库。文库质粒Marker Library plasmid有 150 mmol ・ L—1 3-AT 的 SD/-Leu-Trp-His 平板

上培养3 d后，检测酵母的生长情况。结果发现，阳 性对照几乎长满整个平板，而阴性对照未发现有菌 落长出。观察试验组的情况，发现有零星的单菌落

分布。挑取48个单菌落进行菌落PCR验证，电泳

结果显示，42个菌落可扩增出条带，其中有34个菌 落可扩增出单一条带。另外8个含有多个条带，应

19329 bp4254 bp该是转入了多个质粒所致，为酵母单杂交过程中的 正常现象。然后挑选20个条带较亮的PCR产物送 测序，分析候选基因(图5文库质粒检测Fig.5Examination of the constructed cDNA library plasmidpHIS2-ZjPPHlpro2.7酵母单杂交筛选候选基因本研究采取共转化的方法将10 %L文库质粒

(1 %g・ %L—1 )和5%gpHIS2-ZjPPHlpro质粒共转

图6酵母单杂交最适3-AT浓度筛选Fig 6 Screeningoftheoptimalconcentrationof3-AT

化600 %L准备好的Y187酵母感受态细胞。在含

usedforyeastone-hybridscreening阳性对照Positive controlpGAD-Rec2-53+p53HIS2阴性对照

Negative control pGAD-Rec2-53+pHIS2I单杂筛选One-Hybrid Library screening pHIS2-ZjPPHlpro+AD-cDNA图 7 酵母单杂交筛选Fig. 7 Screening of yeast one-hybrid2.8候选基因的生物信息学分析利用DNAUAN 8.0去除PCR产物测序的载 体序列片段后，利用百迈客云平台的基因功能注释 功能对测序得到的20个候选基因序列进行注释，结 果表明，20个候选基因均可注释到序列信息。Nr

QZea mays)和粳稻(Oryza sati)a Japonica Group)

各3个。GO注释结果表明，这些基因可分为细胞 组分、分子功能和生化过程3大类。在细胞过程、单

一组织进程和代谢过程所含的基因数量最多。

KEGG注释结果显示，这些候选基因富集到了糖酵

同源物种注释结果表明20个注释到的基因中可比 解、柠檬酸循环、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成、丙

对到粟(Staria itllica)的最多有7个，其次是玉米 酮酸代谢路和丁酸甲酯代谢等通路。第 6 期滕 珂等：日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证149120 21 22

23

1 23456789 10 11 12 Marker 13 14 15 16 17 18 19 2425 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Marker 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48图8候选克隆的PCR检测Fig 8 PCRverificationofthecandidateclones注1〜48表示不同候选基因Note1 〜48representingdiferentcandidategenes表1候选基因的生物信息学分析Table1 BioinformaticsanalysisofcandidategenesNCBI登录号NCBIaccessionnumber候选蛋白比对物种GO注释GOannotation—CandidateproteinAlignedspecies稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)MK283737MK283738MK283739假定蛋白 Hypothetical protein线粒体丙酮酸载体 Mitochondrial pyruvate carrier丙酮酸脱氢酶El成分亚单位二穗短柄草(—rachypodium distachyon)短花药野生稻(Oya brachyantha)GO 0005743GO 0004739GO 0009941GO 0003677GO 0005840GO 0003735GO 0000166Beta3pyruvatedehydrogenaseE1componentsubunitbeta-3未知功能蛋白 Uncharacterized proteinMK283741粟｛Setaria italica )高粱(Sorghum bicolor)高粱(Sorghum bicolor)粳稻(Oryza sativa Japonica Group)MK283742MK283743假定蛋白 Hypothetical protein假定蛋白 Hypothetical protein40S 核糖体蛋白 40S ribosomal protein S14MK283744核定位序列结合蛋白MK283740Nuclearlocalizationsequence-bindingprotein粟｛Setaria italica )重金属相关的异戊基植物蛋白MK283745Heavy metal-associatedisoprenylatedplantprotein依赖于ATP的锌金属蛋白酶粟｛Setaria italica )GO 0000302MK283746ATP-dependentzincmetaloprotease粟(Setaria italica )粟(Setaria italica )GO 0004222GO 0005739GO 0043231—MK283747MK283748MG870086未知 功 能蛋白 Uncharacterizedprotein假定 蛋白 Hypotheticalprotein未知 功 能蛋白 UncharacterizedproteinSPX 含蛋白结构域 SPX domain-containing protein石藻(Em11iania huxleyi)玉米｛Zea mays)MK283749粟(Setari.a italica )玉米(Zea mays)玉米｛Zea mays)丫由菜(Brassica napus)GO 0005634—MK283750MK283751MK283752MH428376MH479420未知 功 能蛋白 Uncharacterizedprotein假定 蛋白 Hypotheticalprotein假定 蛋白 HypotheticalproteinNAC 蛋白 NACsuperfamilyproteinAP2/ERF 蛋白 AP2/ERF superfamily proteinSOC1 GO 0016023GO 0005840GO 0003677GO 0009693GO 0004739粳稻(Oryza sativa Japonica Group)粟(Setaria italica )粳稻(Oryza sativa Japonica Group)MK286467蛋白 SOC1protein1492草地学报第27卷

3讨论构建高质量的cDNA文库是利用酵母系统进

定了 NAC,AP2/ERF,SOC1,HGRP,CCH 蛋白和

40S核糖体合成蛋白作为后期试验的候选基因。前

期利用 PlantCARE ( http ：//bioinformatics, psb.

ugent. be)网站分析，在ZjPPHl的启动子序列中

行单杂、双杂筛选互作蛋白的基础。坪观质量很大 程度上决定了草坪草的市场价值，因此，衰老一直是 草坪草研究的一个重要方向。本研究开展之前尚未

发现CGT［G/A］, CArG作用元件，它们分别是

NAC,AP2/ERF转录因子潜在的结合位点。此外,

发现有关构 建日 本结缕 草衰老 叶片 cDNA 文库的 报道，而该cDNA文库的构建对揭示日本结缕草叶

HGRP蛋白主要在维持细胞壁韧性和调节细胞生

长中起作用［Z1\\ CCH蛋白主要分布于衰老叶片的

片衰老进程和叶绿素降解途径的研究十分重要。衡

维管束和叶柄中，可调控铜元素在衰老组织和繁殖 量一个cDNA文库的质量，滴度、重组率和插入片 段的大小是主要的评价指标［16\\ 一般cDNA文库

的滴度要求不少于1. 0X106 cfu - mL_i［17］。cDNA 插入片段的大小以及重组率是另外两个影响文库质

量的重要标准，植物cDNA长度一般大于或者等于

1 kb,文库平均插入片段过小会影响文库质量，而过

度筛除cDNA片段则会造成初始文库的滴度过低，

丢失部分基因信息本研究利用SURT cDNA

合成技术构建的cDNA文库滴度约2. 0 X 106

cfu . mL-1，插入片段平均长度大于1 kb,cDNA片

段插入重组率为100%，表明该文库的完整性很高， 可涵盖绝大多数基因信息，并且达到了高质量的标 准,可满足后续酵母单杂交筛选的要求。酵母单杂交技术是筛选与基因启动子特异结合

转录因子的有效手段，也可以用于鉴定与DNA互 作的蛋白。Chen等利用酵母单杂交技术研究了 拟南芥PPH基因的上游调控转录因子，并证实

SOC1转录因子可直接结合PPH的CArG-box来

调控叶绿素降解。Wang等利用酵母单杂交筛

选，发现苹果UYB22可结合UFGT和QLS基因启 动子的UYBCORE元件来影响黄酮醇的合成(Ua 等™通过酵母单杂交揭示了番茄S1NAP2通过结

合S/SAG113,S/SGR1和SIPAO的启动子来调节 叶片衰老。本研究利用PHIS2酵母单杂交系统，筛

选到50余个可与日本结缕草ZjPPHl启动子结合 的候选菌落，为研究ZjPPHl的转录调控提供了 基础。生物信息学分析表明，随机挑选测序的20个候 选基因都可以在Nr数据库中获得注释。注释到的

20个候选基因比对到粟(Setaria italica )的最多。

尽管结缕草基因组已公布(http：//zoysia. kazusa.

or.jp. /),但此次分析结果显示并未比对到结缕草

相关基因，这可能是由于此版本的Nr数据库不含 结缕草的数据导致。根据已有研究报道并结合 ZjPPH1 启动子序列作用元件分析， 本试验初步确

器官之间的转运［zz\\ 40S核糖体合成蛋白在细胞

增殖中可起到非常重要的作用，其功能的缺失可严

重影响细胞的生长周期。这些蛋白在日本结缕 草叶片衰老和叶绿素降解中的作用和结合的作用元 件仍不清楚， 需要进一步的双荧光素酶系 统和 EU-

SA等试验的验证。GO注释结果显示，这些候选基

因可能主要参与了细胞过程、单一组织进程和代谢 等生物过程。KEGG注释结果表明，这些候选基因

在糖酵解、柠檬酸循环、缬氨酸等通路中起调控作

用。这些生物信息学分析结果为进一步挖掘候选基 因提供了参考。4 结论本研究率先利用SURT cDNA合成技术构建

了日本结缕草衰老叶片的cDNA文库，其滴度为

2. 0X106 cfu . mL-1，插入片段平均长度大于1 kb, cDNA片段插入重组率为100%。该文库的完整性

较高，可涵盖绝大多数基因信息，为酵母单杂交筛选

奠定了基础。利用酵母单杂交技术，筛选到可与ZjPPHl基 因启动子结合的候选基因42个，并对20个候选基

因进行测序和生物信息学分析，初步筛选到6个参 与细胞生长和衰老过程的重要候选基因。为进一步 探索ZjPPHl基因在日本结缕草衰老和叶绿素降

解中的上游调控机制提供了理论支撑。参考文献+1, Gubler U，Hofman BJ'A simpleandveryeficient method

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