２０１７年５月 西南民族大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｉｎｚｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｍａｖ．２０１７ 第４３卷第３期 Ｖｏ１．４３ Ｎｏ．３ ｄｏｉ：１０．１ １９２０／ｘｎｍｄｚｋ．２０１７．０３．００３ 大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测 张焕容 ，徐桂丽 ，刘颂蕊 ，侯蓉 （１．西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都６１００４１；２．成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都６１００８１） 摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）Ｎ基因序列，设计合成１对特异性引物，以犬瘟热病毒疫苗中提取 的ＲＮＡ为阳性模板建立了快速检测ＣＤＶ的ＲＴ．ＰＣＲ方法，结果显示，所建立的ＣＤＶ ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到与理论设计值 大小一致的４５６ ｂｐ的特异性片段，对犬细小病毒（ＰＰＶ）、猪伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、牛轮状病毒（ＢＲＶ）、牛病毒性腹泻病毒 （ＢＶＤＶ）、大肠杆茵（Ｅ．ｃｏｌｉ）和新城疫病毒（ＮＤＶ）的扩增结果均为阴性；最低可检出约１．５３×１０ 拷贝／ Ｌ的核酸；重 复性试验结果表明，该方法检测重复性好．此方法对成都大熊猫繁育研究基地的３７份眼观正常的大熊猫粪便样品检 测，未检测出犬瘟热病毒，与胶体金试纸卡检测结果一致． 关键词：犬瘟热病毒；ＲＴ—ＰＣＲ；大熊猫 中图分类号：￥８５２．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９５－４２７１（２０１７）０３－０２３７－０５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍｆａｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｇｉａｎｔ ｐａｎｄａｓ ＺＨＡＮＧ Ｈｕａｎ．ｒｏｎｇ ，ＸＵＧｕｉ．ｆｉ ，ＬＩＵ Ｓｏｎｇ．ｒｕｉ ，ＨＯＵ Ｒｏｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｉｎｚｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｐ Ｒ Ｃ．； ２．Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｇｉａｎｔ Ｐａｎｄａ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｓｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００８１，Ｐ．Ｒ．Ｃ．） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）Ｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ，ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＶ．Ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ＣＤＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＲＴ－ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＣＤＶ．Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．ａｓ ｆｅｗ ａｓ １．５３×１０ ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ ＣＤＶ ｓｐｅ－ ｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，Ｓｗｉｎｅ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｕｒｓ，Ｂｏｖｉｎｅ Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｕｒｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｃａｓ— ｔｉｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ印ｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｇｉａｎｔ ｐａｎｄａｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３７ ｎｏｒｍａｌ ｇｉａｎｔ ｐａｎｄａ ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｓｅ ｏｆ Ｇｉａｎｔ Ｐａｎｄａ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｅｒｅ ＣＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ；ＲＴ—ＰＣＲ；ｇｉａｎｔ ｐａｎｄａ 犬瘟热病毒（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＤＶ）感染多 科动物不同种之间存在较大的差异，其中以雪貂的易 种动物引起的一种急性、高度接触性传染病，称为犬 感性最高，发病率高达１００％［７－８］．随着自然环境的改 瘟热（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ，ＣＤ） Ｊ．该病呈世界性分布， 变及动物和病毒自身的进化，ＣＤＶ自然感染的宿主范 不仅感染犬科动物中的犬、狼、狐狸等 引，还能感染 围也在不断扩大，给大熊猫这一濒危珍稀动物的生存 鼬科动物，例如黄鼬、貂、雪貂等及浣熊科和猫科等多 带来了极大的威胁．分子生物学的ＲＴ—ＰＣＲ方法已成 种动物 ．发病率和死亡率在不同科动物间，以及同 为目前检测ＣＤＶ常用的方法，但即使完全相同的方 收稿日期：２０１６－１２－２０ 作者简介：张焕容（１９６８－），女，汉族，重庆江津人，教授，博士．研究方向：动物疫病防控．Ｅ—ｍａｉｌ：７２７７４６７６８＠ｑｑ．ｃｏｍ 基金项目：大熊猫繁育研究基金项目（ＣＰＦ２０１５—０３） ２３８ 西南民族大学学报（自然科学版） 第４３卷 法在不同实验室检测的灵敏度会有一定的差异．２０１５ 便样品用ＤＥＰＣ水稀释后提取总ＲＮＡ．将提取的总 ＲＮＡ反转录合成ｅＤＮＡ并置－２０￣Ｃ保存备用．以上述 ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应．ＰＣＲ反应总体系为 ２５ Ｌ，其中１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ，ＥＸ・Ｔａｑ ＤＮＡ聚 年初，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养大 熊猫因感染犬瘟热病毒导致死亡，因此，成都大熊猫 繁育研究基地委托西南民族大学动物医学实验室对 其大熊猫粪便样品进行了ＣＤＶ的检测．本研究同时 合酶（５ Ｕ／ｔｚＬ）０．１５ ｔｚＬ，上、下游引物各０．５ ｉｚＬ，ｃＤ— ＮＡ ２．０ Ｌ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ ｔｚＬ，超纯水调整总 还采用了ＣＤＶ胶体金试纸条对送检的粪便样品进行 了检测，为寻找合适的大熊猫ＣＤＶ检测方法进行了 探索． 体积至２５ ．产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳观察． ＰＣＲ反应程序如下：９４℃预变性４ ｍｉｎ；９４ ｏＣ变性 １材料与方法 １．１ 大熊猫粪便样品及参考菌毒株 ３７份大熊猫新鲜粪便样品采自成都大熊猫繁育 研究基地，采样时取刚排出的新鲜粪便的中段，立即 放人干冰，并保证用干冰运输至实验室，至实验室后一 ８０￣Ｃ保存待检；犬瘟热疫苗（Ｃａｎｉｎｅ Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ Ｖａｅ－ ｃｉｎｅ，ＭＥＲＩＡＬ，ＲＭ２１７０Ｒ１）由成都大熊猫繁育研究基 地提供；犬细小病毒（ＣＰＶ）、猪伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、牛 轮状病毒（ＢＲＶ）、牛病毒性腹泻粘膜病病毒 （ＢＶＤＶ）、大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、新城疫病毒（ＮＤＶ）均由 西南民族大学动物医学实验室分离保存． １．２主要试剂 Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒和 ｐＭＤ１９一Ｔ载体购自大连宝生物工程有限公司；ＤＮＡ 分子量标准均购白天根生化科技（北京）有限公司；胶 回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自美国ＯＭＥＧＡ 公司；感受态细胞Ｅ．ｃｏｌｉ．ＤＨ５ａ、ＥＸ—Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 和ｄＮＴＰ均购自ＴａＫａＲａ公司；犬瘟热病毒胶体金检 测试纸卡购自上海快灵公司． １．３ ＣＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立 １．３．１ 引物设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录ＣＤＶ基因序列，利用Ｐｒｉｍ— ｅｒ ５．０软件设计１对特异性引物，上游引物：５： ＣＧＡＧＴＣ１ｒＩＴＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴｒ＿３，，下游引物：５＂－ＣＣＴＣ－ ＣＡＡＡＧＧ（邢’ＣＣＣＡＴＧＡ一３ ｉ ｌ．３．２ ＲＮＡ的提取与扩增 将犬瘟热病毒疫苗、参考菌毒株和待检大熊猫粪 ３０ Ｓ、５４℃退火３０ Ｓ、７２ ｏＣ延伸４０ Ｓ，共４０个循环； ７２℃延伸８ ｍｉｎ． １＿３．３ ＰＣＲ产物的纯化与克隆 按常规方法纯化ＰＣＲ产物和克隆，克隆阳性菌 落增菌后送公司测序． １．３．４ ＰＣＲ特异性试验 分别取ＢＲＶ、ＢＶＤＶ和ＮＤＶ的反转录产物及Ｅ． ｃｏｌｉ、ＰＲＶ、ＣＰＶ抽提的ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩 增． １．３．５ ＰＣＲ敏感性试验 ｌ０ 一１０ 倍系列稀释的包含ＣＤＶ目的基因片段 的质粒模板经ＰＣＲ扩增，确定ＰＣＲ方法的敏感性． １．３．６ ＰＣＲ重复性及稳定性试验 对ＣＤＶ阳性和阴性核酸用建立的ＰＣＲ检＿２贝４方法 分别批内和批间重复检测３次． １．４大熊猫粪便样品的ＲＴ—ＰＣＲ检测 将成都大熊猫繁育研究基地送检的３７份粪便样 品ｅＤＮＡ用建立的ＰＣＲ方法进行检测． １．５大熊猫粪便样品的胶体金检测卡检测 按上海快灵公司的ＣＤＶ胶体金检测卡说明书要 求，对成都大熊猫繁育研究基地送检的３７份粪便样 品进行检测． ２结果与分析 ２．１ ＣＤＶ ｅＤＮＡ的ＰＣＲ扩增结果 运用设计的特异性引物从犬瘟热疫苗提取的总 ＲＮＡ反转录获得的ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增出了大约 ５００ ｂｐ的片段，与预期扩增片段大小一致（图１）． 第３期 张焕容，等：大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测 Ｍ Ｎ ｌ ２ ３ ２３９ ６００ ５００ ４００ ３００ ５６ ２００ １００ 图１ ＣＤＶ目的片段的ＰＣＲ扩增结果 Ｍ：ＤＮＡ分了质 标准；Ｎ：阴性对照；】～３：ＣＤＶ口的基因ＰＣＲ扩增产物 Ｆｉｇ．１ ＰＣｌ￣ａｍｐｌｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＣＤＶ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｉ：Ｎ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ：１．２ ａｎｄ ３：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＣＤＶ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ２．２ 扩增产物克隆及测序鉴定结果 扩增的目的片段同收后克隆于ｐＭＤＩ９一Ｔ载体获 得的阳性克隆经质粒ＰＣＲ鉴定，结果扩增出约５００ ｂｐ的特异性条带．阳性质粒序列测定结果 ＧｅｎＢａｎｋ 中收录的犬瘟热序列 源性为１００％． ２．３ ＰＣＲ方法的特异性 分别取ＢＲＶ、ＢＶＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ反转录产物 ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ，提取Ｅ．ｃｏｌｉ、ＰＲＶ、ＣＰＶ的ＤＮＡ以及 ＣＤＶ阳性质粒进行ＰＣＲ，结果只有ＣＤＶ阳性质粒能 够扩增出目的条带，其他病毒均未扩增出条带（图 ２）． Ｍ Ｎ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ｂｐ ｌ２【１０ 嚣 ３００ １００ 图２ ＣＩ）Ｖ目的片段阳性克隆质粒的ＰＣＲ扩增结果 Ｍ：ＤＮＡ分 质』｝｝标准：Ｎ： 性刈＿ｌ！ｆ｛；】：ＣＤＶ ］ｌｒｊ 质粒；２：ＰＲＶ；３：ＰＰＶ；４：ＢＲＶ；５：ＢＶＤＶ；６：Ｅ ｃｏｉｌ；７：ＮＤＶ Ｆｉｇ．２ Ａｍｐｌｉｉｆ（，ａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ Ｉ１ｆ ＣＤＶ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ２．４ ＰＣＲ方法的敏感性 陔ＰＣＲ方法最低检ｆ』Ｊ量为１．５３×ｌ０ 拷Ｏｑ．／￣ｉ 的质粒ＤＮＡ（图３）． ２４０ 西南民族大学学报（自然科学版） 第４３卷 Ｍ ２ ３ 蘑５ 零 拿 ：， 虫合蛋宴 、 ‘ ）［９…－１ １ｉ。，…￣ ｃＤｖ 行特异、灵敏、快速的榆测，与商 化的堆于 足Ｄ 竺 皇著 兰警 ｃ ｖ 姜挺釜菇 澳 。 痞銮 繁譬白ｌ １２－１４ ，是要 Ｃ保护性 警曼 妻 果町 吴 ‘ 。 ｌ￣ ． １２ 体产生较强的抗体反应发挥体液免疫功能 黧能１６ｉ刺 ． Ｐａ ｓｃａ…ＤＶ Ｎ． …、…，荔 一 ～ “～ 的方 …… 一 ！一…… 第３期 张焕容，等：大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测 ２４１ ［３］ＣＵＮＮＩＮＧＨＡＭ，ＳＨＩＮＤＬＥ，ＡＬＬＩＳＯＮ，ｅｔａ１．Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ ｉｎ ｅｖｅｒｓｌａｄｅｓ ｍｉｎｋ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９，４５（４）： ｌ１５０．１ １５７． ［４］ＧＯＲＤＯＮ Ｃ Ｈ，ＢＡＮＹＡＲＤ Ａ Ｃ，ＨＵＳＳＥＩＮ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｉｎ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｅｔｈｉｏｐｉａｎ Ｗｏｌｖｅｓ［Ｊ］．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２０１５。２１（５）：８２４￣３２． ［５］ＶＩＡＮＡ Ｍ，ＣＬＥＡＶＥＬＡＮＤ Ｓ，ＭＡＴｒＨＩＯＰｏｕＬ０ｓ Ｊ，ｃｔ １ａ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ａ ｍｏｒｂｉＪｌｉｖｉｒｕｓ ａｔ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ—ｗｉｌｄｌｉｆｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉ． ｍｓ ｉｎ ｄｏｍｅｓｉｔｃ ｄｏｇｓ ｎａｄ ｌｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ— ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０１５，Ｉ１２（５）：１４６４— １４６９． ［６］ＤＥＥＭ Ｓ Ｌ，ＳＰＥＬＭＡＮ Ｌ Ｈ，ＹＡＴＥＳ Ｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｉｎ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｌａ ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏ ａｎｄ Ｗｉｌｄｌｉ￣Ｍｅｄｉ． ｃｉｎｅ，２０００，３１（４）：４４１－４５１． ［７］ＬＯＦＦＬＥＲ ｓ，ＬＯＴＴＳＰＥＩＣＨ Ｆ，ＬＡＮＺＡ Ｆ，ｅｔ ａ１．ＣＤ９，ａ ｔｅｔｒａｓｐａｎ ｔｒｎａｓ． ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｎｄｅｒｓ ｃｅｌｌｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，７１（１）：４２－４９． ［８］张淼，刘清彪，刘宗架，等．犬瘟热病原学研究进展［Ｊ］．中国畜牧 兽医，２００９，３６（１１）：１６２．１６５． ［９］赵建军，闫喜军，吴威．犬瘟热病毒基因变异及其细胞受体研究进 展［Ｊ］．微生物学报，２００８，４８（７）：９８６－９９１． ［１０ Ｊ张海瑞，翟军军，才学鹏．麻疹病毒属病毒非结构蛋白结构及功 能研究进展［Ｊ］．中国预防兽医学报，２０１５，３３（７）：５７７－５８０． ［１１］ＫＡＭＥＯ Ｙ，ＮＡＧＡＯ Ｙ，ＮＩＳＨＩＯ Ｙ，ｅｔ ａＬ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｆｎｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｗｉｌｄ ｍａｍｍａｌｓ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。 ２０１２，１５４（３）：２２２－２２９． ［１２］ＧＵＯ ＬＩＮＧ，ＹＡＮＧ ＳＨＡＯ—ＬＩＮ，ＷＡＮＧ ＣＨＥＮＧ．ＤＯＮＧ．ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌ０＿ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｕｒｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｉｎａｔ ｐａｎｄａ ｎａｄ ｒａｃｃｏｏｎ ｄｏｇｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｖｉ． ｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，１０（１）：１－７． ［１３］翟军军，才学鹏．犬瘟热病毒核衣壳蛋白分子生物学研究进展 ［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００９，３１（９）：７４５－７４８． ［１４］ＧＡＯ ＷＡ，ＹＡＮＧ ＪＩＮＧ，ＣＨＥＮ ＺＨＥＮ．ＷＥＮ．Ｓｔｕｄｙ ａｄｖｎａｃｅ ｉｎ ｍｏｌｅｃ． ｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｕｒｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒ－ ａｆｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，１４（４）：２４１－２４４． ［１５］秦立得，蒋伟，王喜军，等．犬瘟热病毒融合蛋白、血凝蛋白、基质 蛋白和核衣壳蛋白基因ＤＮＡ联合免疫的研究［Ｊ］．中国预防兽医 学报，２０１５，３７（７）：５４９－５５２． ［１６］ＣＨＥＲＰＩＬＬＯＤ Ｐ，ＢＥＣＫ Ｋ，ＺＵＲＢＲＩＧＧＥＮ Ａ，ｅｔ １ａ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｎａｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｔａｔｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍ． ｐｅｒ ｖｉｕｒｓ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ａ７５／１７［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，７３ （３）：２２６３２２６９． ［１７］庄金秋，梅建国，沈志强．犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展 ［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１２，４４（８）：９０－９４． ［１８］苏凤艳，李哲，刘干辉，等．犬瘟热诊断技术的研究进展［Ｊ］．中国 畜牧兽医。２０１５，４２（５）：１３１８．１３２４． （责任编辑：李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑：周序林，郑玉才）
