母猪高致病性蓝耳病检测中的荧光RT—PCR法分析

母猪高致病性蓝耳病检测中的荧光RT—PCR法分析

作者：付长英

来源：《农家科技下旬刊》2014年第09期

摘 要：应用荧光RT—PCR方法对某地区8个生猪重点养殖地区的50份血液样品、10份组织病料以及10个规模化猪场的81份血液样品、19份组织病料进行高致病性蓝耳病检测，其检测结果均为阴性，说明该地区猪群没有高致病性蓝耳病的健康带毒和感染。同时对荧光RT—PCR技术在母猪高致病性蓝耳病的检测进行分析。 关键词：高致病性蓝耳病；荧光RT—PCR法；检测

高致病性蓝耳病是由猪繁殖及呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病，这种疫病会对养猪业造成巨大的经济损失，严重的影响养猪业的发展，因此，对高致病性蓝耳病感染进行检测有十分重要的作用。目前，检测高致病性蓝耳病感染的方法有很多，如抗体检测、抗原检测、病毒分离等，这些方法的主观性比较强，操作过程比较复杂，准确度低，难以准确检测出高致病性蓝耳病。荧光RT—PCR方法能准确、快捷、敏感的检测出高致病性蓝耳病，为了解某地区10个规模化猪场、8个生猪重点养殖地区的高致病性蓝耳病感染状况，该地区检测人员决定采用荧光RT—PCR方法进行高致病性蓝耳病检测。 一、材料与方法

（一）试验主要仪器设备及试剂

在本次试验中，主要仪器设备有生物安全柜、SIGMA高速冷冻离心机、ABI Prism 7500荧光PCR仪；试验使用的主要试剂有病毒RNA提取试剂盒、高致病性蓝耳病实时荧光RT—PCR检测试剂盒；试验的主要材料有来自该地区10个规模化猪场、8个生猪重点养殖地区的血液样本以及淋巴、脾等组织病料。 （二） 操作方法

1. 样本前处理。将血液样品放入离心机中，按8000r/min的转速离心2min，然后取出100μL血清，并加入300μL变性液，混合均匀。取0.5g组织样品，然后加入PH为7.2的PBS1.5ml，研磨均匀后，放入离心机中，按8000r/min的转速离心2min，取100μL上层清液，并加入300μL变性液，混合均匀。

2. 制备模板。取多个1.5ml的灭菌离心管，并用DEPC水进行处理，然后将30μL已经处理过的样品加入灭菌离心管中，并加入300μL酚—氯仿—异戊醇液、30μL醋酸钠溶液，颠倒

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几次，混合均匀，然后冰浴15min。冰浴结束后，在4℃下，按12000r/min的转速离心15min，然后取300μL上层清液，加入异丙醇液300μL，混合均匀，放入-70℃的冰箱中，30min后取出，并在室温溶化。然后在4℃下，按12000r/min的转速离心20min，去掉上层清液，滴入75%乙醇1ml，旋转一周后，将离心管倒扣在吸水纸上1min，真空抽干15min，最后加入RNA酶抑制剂与灭菌去离子水混合液10μL，储存在-20℃。

3. 扩增试剂准备。所需溶解试剂球数需要根据反应管总数计算出来，每个试机球需要Taq酶0.5μL及试机球溶液40μL。在冰上将试剂溶解，并将试剂充分摇匀，计算好各种试剂的使用量，并加入1.5ml灭菌离心管中，混合均匀后，按2000r/min的转速离心10s，然后将20μL混合液加入设定的PCR反应管中，并将2μL混合液加入阴、阳性对照管及样本模板上，盖好管盖，放入ABI Prism 7500荧光PCR仪中进行检测。

4.荧光RT—PCR扩增与信号收集。在本次试验中，荧光RT—PCR的反应体系为25μL，反应条件为42℃反应30min、95℃反应10min，此次反应为1个循环；95℃反应10min、45℃反应30s、72℃反应60s，此次反应为5个循环；95℃反应15s、58℃反应60s，此次反应为40循环，当反应在58℃下进行时，开始收集荧光信号。 二、结果分析 （一）结果判定标准

如果检测样本的Ct值等于或者小于35，并且扩增曲线有明显的指数增长期，则可以判定为阳性；如果检测样本的Ct值大于35、小于40，重复一次后，发现Ct值扔大于35、小于40，并且扩增曲线有明显的指数增长期，则可以判定为阳性，如果不是这种现象，则可以判定为阴性；如果检测样本的Ct值大于40，或者检测不到样本Ct值，则可以判定为阴性。 （二）重复性与稳定性试验

采用荧光定量RT—PCR方法重复3次检测病毒核酸含量为1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL样品，从图1可以看出荧光RT—PCR法具有良好的稳定性。从图2可以看出，R2=0.997，Ct值等于小于33，并且具有良好的线性关系，说明荧光RT—PCR法具有良好的稳定性。

（三） 敏感性试验

用紫外分光光度法测定已知的高致病性蓝耳病阳性核算的浓度，然后按10倍梯度进行稀释，发现能检测到10-7层次，说明荧光RT—PCR方法具有很高的灵敏度。 （四）样品检测

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采用荧光RT—PCR方法对采集的样品（8个生猪重点养殖地区的50份血液样品、10份组织病料，10个规模化猪场的81份血液样品、19份组织病料）进行高致病性蓝耳病检测，发现检测结果均为阴性，说明该地区猪群没有高致病性蓝耳病的健康带毒和感染。 三、结语

高致病性蓝耳病的诊断方法有间接免疫荧光试验、病毒中和试验等，这些诊断方法的灵敏度比较低，特异性不强，并且操作比较复杂，普通的RT—PCR方法容易出现假阳性，还容易产生EB等有害物质。Tap探针实时荧光RT—PCR方法具有良好的特异性、敏感性，检测速度快，检测结果准确，在高致病性蓝耳病检测中有十分广泛的应用。

近年来，随着高致病性蓝耳病的增加，要加大高致病性蓝耳病检测力度，并做好预警工作，避免发生疫情。通过本次试验，能有效地看出荧光RT—PCR方法在高致病性蓝耳病检测中的应用，因此，实际检测中，要合理的运用荧光RT—PCR方法，为畜牧业的健康发展提供保障，从而有效地促进国民经济的发展和和谐社会的构建。 参考文献：

[1] 曹火仁，顾晓峰，朱骏等.荧光定量PCR在高致病性猪蓝耳病检测上的应用[J].四川畜牧兽医，2010，（06）：125-126.

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[3] 王孝忠，梅小伟，张忆群，张敏.宜昌部分地区高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测[J].湖北畜牧兽医，2012， （05）：117-118.