布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价中文摘要中文摘要目的：通过酯化反应制备新型布洛芬．丹皮酚偶合物（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ．ｐａｅｏｎｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＩＰＣ），以提高治疗效果和降低布洛芬对胃肠道的刺激性。本文主要对］ＰＣ的制剂学性质、药动学、药效学和胃肠道刺激性等进行了系统的评价研究。方法：（１）建立ＩＰＣ的ＨＰＬＣ分析方法后，测定了ＩＰＣ的溶解度、油水分配系数、不同ｐＨ环境和血浆中的稳定性；（２）在制备和评价ＩＰＣ亚微乳的基础上，采用在体单向灌流法，考察了大鼠不同肠段的吸收情况；（３）通过股静脉注射给药后，进行了大鼠体内ＩＰＣ药动学研究；（４）采用小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法考察了ＩＰＣ的抗炎镇痛作用；（５）通过小鼠胃组织的病理切片观察、炎症因子的测定，评价了ＩＰＣ对胃肠道的刺激性。结果：（１）ＩＰＣ的脂溶性很强，在高温条件下发生部分降解，高湿及强光照射影响不大；在酸性条件下相对稳定，在体外血浆中很快发生降解，半衰期约为１．７８ｍｉｎ。（２）制得ＩＰＣ亚微乳的大小为１８２ｑ－２ｎｍ，分布均匀，含量为９．２２８ｍｇ·ｍＬ～；空肠段的吸收速率明显高于其它部位，ＩＰＣ浓度影响吸收速率。（３）大鼠股静脉注射Ｉｂｕ溶液、ｌｂｕ亚微乳和ＩＰＣ亚微乳后，消除半衰期（ｔｌ尼）分别为２５．７５ｑ－４．５４，２７．８８４－５．９０和２９．０４ｑ－７．８６ｒａｉｎ，ＡＵＣ为１８１．８１，１９７．４５和１２１．１９ｍｇ．ｍＬ－１．ｍｉｎｑ。（４）ＩＰＣ具有良好的抗炎镇痛作用，但对ＤＰＰＨ·的清除率与Ｉｂｕ相似。（５）病理切片观察及胃组织中ＮＯ、ＭＤＡ、ＰＧＥ２测定结果表明，ＩＰＣ对小鼠胃肠道刺激性有显著降低的趋势。结论：ＩＰＣ的水溶性有待于提高，在血浆中可迅速发生分解释放出母体药物，空肠段有良好吸收；偶合物的消除半衰期略有延长；在相同剂量下，ＩＰＣ具有比Ｉｂｕ更好的抗炎镇痛效果，且刺激性下降。关键词：布洛芬；丹皮酚；偶合物；体内外评价作者：韩莎指导老师：崔京浩Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎ·－ｐａｅｏｎｏｌｃｏｎｌ一，一ｕｇａｔｅＡｂｓｔｒａｃｔｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ａｎｏｖｅｌｉｂｕｐｒｏｆｅｎ－ｐａｅｏｎｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＩＰＣ）ＷａＳｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｅｓｔｅｒｉｆｉｅａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｄｅｃｒｅａＳｅｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（ＧＩ）ｔｒａｃｔｉｒｒｉｔａｔｉｏｎｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎ．ＴｈｅｓｙｓｔｅｍｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆＩＰＣｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｆｉｚａｔｉｏｒｔ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｐｈａｒｒｎａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓａｎｄＧＩｉｒｒｉｔａｔｉｏｎｏｆｌＰＣ．Ｍｅｔｈｏｄ：（１）ＡｆｔｅｒｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｏｆＩＰＣ，ｔｈｅｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅｐａｒｔｉｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓｍａｏｆＩＰＣｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（２）ＲａｔｓｉｎｇｌｅｐａｓｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｒｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆＩＰＣｉｎｖａｒｉｏｕｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｅｇｍｅｎｔｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｓｕｂｍｉｅｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ．（３）ＴｈｅｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｙｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｆｔｅｒｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＰＣｓｕｂｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｉｎｔｏｒａｔｓ．（４）Ｔｈｅａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｇｅｓｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩＰＣｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｏｎｔｈｅｘｙｌｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｅａｒｅｄｅｍａａｎｄａｃｅｔｉｃａｃｉｄｉｎｄｕｃｅｄｗｒｉｔｈｉｎｇｍｏｄｅｌｍｉｃｅ．（５）ＧＩｔｒａｃｔｉｒｒｉｔａｔｉｏｎｔｅｓｔｏｆＩＰＣｃｏｍｐａｒｅｄｗｉ廿ｌｉｂｕｐｒｏｆｅｎｗｅｒｅａｌｓｏｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｅｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：（１）ＩＰＣｓｈｏｗｅｄｖｅｒｙｈｉ曲ｌｉｐｏｐｈｉｌｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐａｒｔｌｙｄｅｇｒａｄｅｄｉｎｈｉ曲ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗｈｉｌｅｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｈｉｇｌｌｈｕｍｉｄｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｌｉｇｈｔ．ＩＰＣｄｉｓｐｌａｙｅｄｍｏｒｅｓｔａｂｌｅｉｎａｃｉｄｉｃｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ａｎｄｄｅｇｒａｄｅｄｅａｓｉｌｙｉｎｒａｔｐｌａｓｍａｗｉｍｓｈｏｒｔｈａｌｆｌｉｆｅｏｆ１．７８ｍｉｎ．（２）ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｓｉｚｅｏｆｌＰＣｓｕｂｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｗａｓ１８２４－２ｎｌｎ、）￣，ｉｎｌｎａｒｒｏｗｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＰＣｗａｓ９．２２８ｍｇ‘ｍＬ一．Ｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｎｓｔａｎｔ（Ｋａ）ｏｆＩＰＣＷａｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｐｅｒｆｕｓｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＫａｉｎｊｅｊｕｎｕｍｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｈｉｌｅｃｏｍｐａｒｅｄ、７ＩｒｉｔｌｌｏｔｈｅｒｐａｒｔｓｏｆＧＩｔｒａｃｔ．（３）Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐ．ｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈａｌｆｌｉｆｅｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｉｂｕｐｒｏｆｅｎｓｕｂｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎａｎｄＩＰＣｓｕｂｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｗｅｒｅ２５．７５４－４．５４．２７．８８４－５．９０ａｎｄＩｌＩｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｂｕｐｒｏｆｃｎ—ｐａｅｏｎｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｅＡｂｓｔｒａｃｔ２９．０４４－７．８６ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｌｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＡＵＣｗｅｒｅ１８１．８１，１９７．４５ａｎｄ１２１．１９ｍｇ·ｍＬ－１．ｍｉｎ＂１．（４）ＩＰＣｓｈｏｗｅｄｍｏｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｇｅｓｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｐｈａｎｎａｃｏｄｙｎａｍｉｃｔｅｓｔ，ｂｕｔｓｉｍｉｌａｒｅｆｆｅｃｔｉｎＤＰＰＨ‘ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｔｅｓｔｃｏｍｐａｒｅｄ诵ｍＩｂｕ．（５）ＴｈｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＭＤＡ，ＰＧＥ２ａｎｄＮＯｉｎｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＩＰＣｃｏｕｌｄｄｅｃｒｅａｓｅａｄｖｅｒｓｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｒｅｖｉｓｏｕｓｓｔｕｄｙｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔ：ｔｈｅｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｏｆＩＰＣｉｓｎｅｅｄｅｄｔｏｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄ；ｔｈｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｃｏｕｌｄｂｅｄｅｇｒａｄｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙｉｎｐｌａｓｍａ；ｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆＩＰＣＷａｓｈｉｇｈｅｒａｔｔｈｅｐａｒｔｏｆｊｅｊｕｎｕｍ；ｔｈｅｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｈａｌｆｌｉｆｅｏｆＩＰＣａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩＰＣｗｅｒｅｔｒａｃｔｗａｓｐｒｏｌｏｎｇｅｄ，ｍｏｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄａｎａｌｇｅｓｉｃｄｉｓｐｌａｙｅｄｃｏｍｐａｒｅ、＾，ｉｔｌｌｓａｍｅｄｏｓｅｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎｅｖｅｎｔｈｅｉｒｒｉｔａｔｉｏｎｏｆＧＩｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ；ｐａｅｏｎｏｌ；ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎＷｒｉｔｔｅｎｂｙＨａｎＳｈａＳｕｐｅｒｖｉｓｅｄｂｙＣｕｉＪｉｎｇｈａｏＩＩＩ布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第一章文献综述第一章文献综述ｌ布洛芬衍生物的研究进展非甾体抗炎药（ＮＳＡＩＤｓ）是临床上治疗风湿性、类风湿性关节炎和骨关节炎的重要药物，其主要作用机制是抑制了致炎前列腺素（ＰＯｓ）的生物合成，从而改善炎症部位充血、肿胀、疼痛等症状。传统的ＮＳＡＩＤｓ选择性差，既抑制炎症部位ＰＧｓ的生物合成，也抑制了对胃粘膜有保护作用的胃肠道ＰＧｓ的生成。所以，长期应用该类药物可引起胃肠道溃疡、出血甚至穿孔等严重不良反应，从而了其临床应用【¨。目前常用的非甾体类抗炎药很多，大致可分为以下几种：（１）水杨酸类：如乙酰水杨酸，即阿司匹林；（２）苯丙酸类：如布洛芬、萘普生等；（３）吲哚类：有吲哚美辛、奇诺力等；（４）灭酸类：有甲灭酸、氯灭酸、双氯灭酸和氟灭酸等；（５）乙酸类：以双氯芬酸钠为最常用；（６）喜康类：炎痛喜康等；（７）吡唑酮类：有保泰松，羟基保泰松等。ｊ布洛芬，化学名为４．异丁基．２．苯丙酸，２０世纪６０年代由英国（Ｂｏｏｔｓ）￥１Ｊ药公司研究所独家生产，并于１９６９年开始用于临床【２】。该药最常见的不良反应是胃肠系统，其发生率高达３０％，从腹部不适到严重的出血或使消化道溃疡复发等。为了降低布洛芬对胃肠道的副作用，提高其溶解度，常采用羧基酯化或成盐的方法。最近，也有制备ＮＯ供体型布洛芬的研究报道。本文简要综述布洛芬衍生物的研究进展。１．１酯类衍生物酯类衍生物的数量最多，它在体内可均匀缓慢释放母体药物，避免了吸收快、排泄也快的“峰谷效应”。布洛芬的胃肠道副反应主要是由于结构中羧基的存在，酯类衍生物可将羧基隐藏，达到降低刺激性的目的。Ｋｈａｎ［３１等研究了布洛芬的甘油三酯衍生物，利用不直接接触胃粘膜来降低胃刺激，同时通过甘油酯的吸收特性提高布洛芬的生物利用度。甘油三酯是脂肪的主要成分，它的吸收主要是通过胰脂肪酶对甘油一酯及游离脂肪酸的简单水解，水解产物不会产生毒副作用。大鼠脚趾角叉菜胶致炎实验结果表明，布洛芬甘油三酯衍生物比布洛芬具备更好的抗炎活性，且衍生物引起溃疡所需要的药物剂量第一章文献综述布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价是布洛芬的两倍。Ｗｅｇｒｚｙｎｓｋａ［４】等研究了布洛芬与３．羟基丁酸的偶合物。研究结果表明，由于布洛芬的碱金属盐造成的（Ｒ，Ｓ）－ｂ一丁内酯的阴离子开环聚合，可以建立一个药物与３．羟基丁酸偶合的简便的方法。细胞实验发现，布洛芬与３．羟基丁酸的偶合物对ＨＴ－２９和ＨＣＴ１１６结肠癌细胞的抑制率明显高于布洛芬。在小鼠急性毒性实验中，偶合物表现出较低毒性。国内很多研究者尝试将布洛芬与具有羟基的有效化合物偶合，当偶合物经过胃肠道时，因为酯类对胃肠道的保护作用，降低了对胃肠道的刺激性；进入血液后，酯类很快降解，布洛芬与有效化合物产生协同作用。如马涛【５】等，以布洛芬和川芎嗪为原料合成的新型抗炎镇痛药。研究表明，布洛芬川芎嗪酯具有抗炎和镇痛作用，与相同摩尔质量的布洛芬作用相当，而其胃肠道刺激性小于布洛芬。这可能因为成酯后避免了布洛芬对胃肠道的直接刺激；另一原因可能是由于该药进入血液后分解产生的川芎嗪对胃溃疡具有防治作用。布洛芬愈创木酚酯（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎｇｕａｉａｃｏｌｅｓｔｅｒ）［６１是布洛芬和愈创木酚合成的一种新药，１９８９年由意大利Ａｎｇｅｌｉｎｉ公司研发上市，商品名为Ｂｅｎｆｌｏｇｉｎ。该药在胃肠道中不降解，但是进入血液后分解为布洛芬和愈创木酚，从而发挥布洛芬的解热镇痛、消炎作用。布洛芬愈创木酚酯与布洛芬相比，可明显降低胃肠道的刺激性，且兼有祛痰和镇咳之功效。在我国目前也处于新药研制阶段。此外，赵秀丽【７】等还研究了布洛芬丁香酚酯。抗炎和镇痛结果表明，布洛芬丁香酚酯具有良好的抗炎和镇痛作用，且布洛芬丁香酚酯对胃肠道的刺激性明显小于布洛芬和丁香酚。赵一玫【８】等则运用前药设计的原理，以布洛芬为先导化合物，分别将其与对羟基苯甲酸、水杨酸、对乙酰氨基酚和５．（２．羟基苯基）．１０，１５，２０．三甲氧基苯基卟啉进行酯化得到４种衍生物。药效学评价结果，布洛芬与水杨酸或对乙酰氨基酚形成酯类化合物后抗炎活性明显增强。１．２布洛芬的糖苷衍生物Ｕ１１ｒｉｇ【９】等利用萄糖与布洛芬连接的方法，提高了药物的生物利用度。ＨｅｎｋＳｗａｒｔＵｏ】等分别将葡萄糖、甘露糖与布洛芬连接，研究了衍生物的透皮吸收特性。ＸｉａｎｇｇｕｏＺｈａｏ［ｕ］等改进了合成布洛芬糖类衍生物的方法，由于酶的单一性和高选择性，运用酶作为催化剂合成了布洛芬葡糖苷酯，评价了其在体内和体外的水解稳定性、抗炎镇痛活性及对小鼠胃肠道的刺激性。此类布洛芬葡糖苷酯具有良好２布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第一章文献综述的镇痛和抗炎活性，但是对小鼠胃肠道的刺激性显著降低。宋妮【１２】等以半乳糖、２．氨基葡糖、２．乙酰氨基葡糖和乳糖为起始原料得到目标化合物所得目标化合物均未见文献报道。药理实验结果表明，半乳糖、２．氨基葡糖与布洛芬的衍生物有显著的抗炎活性，且均优于布洛芬。１．３氨基酸类衍生物非甾体抗炎药物可以用于治疗风湿、关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎等疾病。但是，由于骨组织的硬度大、渗透性差、生理生化过程特殊等原因，治疗药物很难有效到达作用部位。据报道【１３１，天冬氨酸六肽具有亲骨性，为得到可能具有趋骨性的非甾体抗炎药，研究人员设计合成了Ｌ－天冬氨酸六肽．布洛芬。布洛芬易溶于乙醇、丙酮、氯仿或乙醚，但在水溶液中几乎不溶。为了增强其水溶性、提高生物利用度并降低对肠胃粘膜的刺激性，人们已经合成了Ｌ．精氨布洛芬。最近，王齐放【１４】等将布洛芬与Ｌ．赖氨酸制成复合物后，其水溶性明显增加，布洛芬在水中的溶解度达到１００ｍｇ·ｍＬ～。另外，Ｐａｈａ【”】等发现布洛芬精氨酸衍生物中，精氨酸作为产生ＮＯ的酶的底物，有益于发挥抗炎作用。１．４一氧化氮供体型衍生物一氧化氮供体型布洛芬的设计思想是基于ＮＯ和ＰＧｓ在胃肠道的功能具有类似性和互补性，适量补充ＮＯ可以减少或消除布洛芬抑制胃肠道ＰＧｓ生物合成所引起的副作用。ＮＯ．布洛芬的设计方法是将布洛芬与ＮＯ供体通过一些连接基团相偶连而成，在体内释放出原药及ＮＯ而发挥作用，因此ＮＯ．布洛芬应属于协同前药的范畴。在布洛芬分子结构中引入酯类ＮＯ．供体所得化合物ｌ在体内释放原药和ＮＯ，胃肠道毒副作用明显低于布洛芬【１６】。图１．１化合物１Ａｂｄｅｌｌａｔｉｆ［１７１等研究了化合物２作为ＮＯ供体与布洛芬反应生成化合物３。化合物３是ＮＯＮＯ．布洛芬衍生物。通过大鼠角叉菜胶实验发现，ＮＯＮＯ．布洛芬衍生物的抗炎活性高于布洛芬单体。３第一章文献综述布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价Ｑ人／ｏＶ丫嘞耋ｖ／图１．２化合物２／Ｖ、汕６Ｉ图１．３化合物３１．５其他孙礼林ｆ１８】等将布洛芬制成可聚合的含布洛芬的单体，再通过自聚，共聚和乳液聚合制备含布洛芬的高分子药物及纳米药物微球。由于纳米粒子既能穿过组织间隙被细胞吸收，又可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障，显示诸多优越性。胺类化合物，如乙二胺，在药物制剂中被作为助溶剂用于增加药物的溶解度。为了提高布洛芬的溶解度，周金森【１９】等首次介绍了乙胺盐Ｃ１３０２ＨＩＴ＂ＥｔＮＨ３和７，－－胺盐Ｃ１３０２Ｈ１７·（ＮＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３）ｏ．５的合成，其中乙胺盐极易溶于水。Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙｌ２０】等合成了氧矾与布洛芬的偶合物。布洛芬与氧矾的偶合物对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１和ＵＭＲｌ０６成骨细胞来说，是一种比较好的抑制剂，但是浓度过大时，对ＭＣ３Ｔ３Ｅ１有毒性。１．６展望长期以来，布洛芬在临床上广泛应用，但是胃肠道副作用是其应用的主要原因。目前，除开发选择性ＣＯＸ－２抑制药外，研制前体药物也是重要途径之一。这类ＮＳＡＩＤｓ的前药应在胃肠道中稳定，而在血浆或靶组织中易水解，以达到降低胃肠道不良反应的目的。自从发现ＮＯ对胃肠道的保护作用以来，人们对ＮＯ－ＮＳＡＩＤｓ进行了广泛的研究，并取得了重要进展，已有一些新化合物在进行临床研究。近来不断有新的ＮＯ供体被发现，为开发ＮＯ－ＮＳＡＩＤｓ提供了更广阔的空间。随着研究的深入，在此领域内可能有一些较好的新药问世，造福于人类。４布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第一章文献综述２丹皮酚的主要药理作用概述丹皮酚（ｐａｅｏｎ０１），化学名２．羟基．４．甲氧基苯乙酮，是牡丹干燥根或全根的主要有效成分，味苦、辛，性微寒，具有抑菌抗炎、解热镇痛、降压利尿、抗凝血、抗过敏、增强免疫功能等作用，在医药、香料、化工领域应用广泛。但是，丹皮酚熔点低，易挥发，且水溶性差【２１１。现代药理实验表明，丹皮酚主要有以下的药理作用。２．１镇痛消炎作用刘爱敏瞄１等运用热板法和醋酸扭体法对丹皮酚的镇痛作用进行了研究，发现丹皮酚的高、中、低剂量组均表现出一定的镇痛作用。汤文璐【２３】等考察了丹皮总苷对角叉菜胶致大鼠急性足爪肿胀模型和二甲苯诱导小鼠耳片水肿模型的抗炎效果，结果表明，丹皮总苷均有明显的抑制作用。２．２抗氧化作用吴晓慧１２４］等的研究表明，丹皮酚具有较强的清除超氧阴离子自由基（０２．）、羟自由基（·ＯＨ）及抗过氧化氢（Ｈ２０２）、紫外线（ＵＶ）诱导的红细胞溶血的活性，认为丹皮酚可成为高效的天然抗氧化剂新资源。ｏ．２．３抗肿瘤作用丹皮酚对体外培养的人红白血病细胞Ｋ５２６、人乳腺癌基因细胞Ｔ６．１７和肝癌细胞ＢＥＬ．７４０４均有抑制作用，并对小鼠移植性肝癌ＨｅｐＡ具有明显抑制作用【２５１。２．４抗茵、抗变态反应及免疫作用据报道【２６１，丹皮酚对黄色八叠球菌、福氏痢疾杆菌、枯草芽孢菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等五种供试细菌均有较强的抑制作用。丹皮酚对ＩＩ、ｎＩ和Ⅳ变态反应均有抑制作用，尽管不抑制特异性抗体的形成，但能抑制补体经典激活途径的溶血活性【２７】。低浓度丹皮酚可以增加Ｔ淋巴细胞在血液循环中的比例，还能使Ｔ淋巴细胞发挥更强的淋巴因子分离功能，即低浓度丹皮酚有促进细胞免疫的作用【２引。另外，朱作金等【２９】研究发现丹皮酚雾化经呼吸道吸入不仅能提高机体肺局部非特异性免疫功能，而且还可提高全身性细胞免疫和体液免疫功能。２．５改善心脑血管作用丹皮酚在改善心脑血管方面有很多重要的作用：抗心肌缺血再灌注性损伤作用、抗心律失常作用、抗动脉粥样硬化作用、改善血流变等【３０，３１】。由于丹皮酚结构中含酚羟基，熔点低、易挥发，室温放置很不稳定。为提高５第一章文献综述布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价丹皮酚的稳定性、提高药理活性，有必要将其结构进行修饰。近年来，国内外对丹皮酚的药理及应用方面报道非常多，而在其衍生物方面的研究非常少，且主要集中在丹皮酚Ｓｃｈｉｆｆ碱化合物及其配合物。丹皮酚与布洛芬同样具有镇痛抗炎作用，且结构中含有酚羟基，可与布洛芬的羧基发生反应生成酯类化合物，有可能发挥降低布洛芬对胃肠道的刺激性和提高丹皮酚稳定性的作用。３静脉注射亚微乳概述亚微孚Ｌ（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎｅｍｕｌｓｉｏｎ）是一种以油相、乳化剂、水相制成粒径在１００＂－－５００ｎｍ范围的水包油型（ｏ／ｗ）孚Ｌ剂，外观呈浑浊或乳状，可热压灭菌，但加热时间太长或数次加热，也会分层。亚微乳常作为胃肠外给药的载体，其特点是可提高难溶性药物的溶解性、易水解药物的稳定性，降低毒副作用，提高生物膜通透性，使药物具有缓释、控释或淋巴靶向性，并可作为静脉注射【３２１。３．１亚微乳的组成静脉注射亚微乳由油相、乳化剂、助乳化剂和水相组成，制备时需要外界提供较强的机械分散力，如高压均质或超声波等。当其作为给药载体时，脂溶性药物溶解在油相中。静脉注射亚微乳应符合以下要求：无菌、等张、无热原、无毒、可生物降解、生物相容、理化性质稳定等。所以，亚微乳的组分选择非常重要，首先各组分之间应能相互配合在剪切之后形成初乳，在制成亚微乳后又能保持体系的稳定性，各组分还应无毒、无刺激性。３．１．１油相供静脉注射用油要求成分较纯，形成的乳剂毒副作用小，化学性质较稳定。目前，油相主要用植物来的长链甘油三酯，如大豆油、藏红花油、玉米油等【３３１。近年来，在脂肪乳处方中较多采用中链甘油三酯，它们是含６．１２个碳原子的脂肪酸甘油酯，在水中的溶解度比长链的大１００倍，能帮助提高脂溶性药物在乳剂中的浓度【３２１。３．１．２乳化剂亚微乳中乳化剂用量一般不超过亚微乳总量的１０％。静脉注射亚微乳最常用的天然乳化剂是卵磷脂和大豆磷脂【３４１。离子型表面活性剂应用于皮肤时易产生皮肤刺激性，因此常使用非离子型表面活性剂如聚山梨酯．８０、泊洛沙姆、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。其它如脂肪酸甘油酯、司盘等也常用作乳化剂。其他合成乳化剂大多有溶血作用。３．１．３助乳化剂多数助乳化剂为短链醇类，但考虑刺激性问题，仅少数助乳６布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第一章文献综述化剂如丙二醇、甘油等能够药用，其它如戊醇、己醇等则因刺激性较大不能使用。亚微乳中的助乳化剂可插入Ｎ－／Ｌ化剂界面膜中，形成复合凝聚膜，提高膜的牢固性和柔顺性，又可增大乳化剂的溶解度，进一步降低界面张力，有利于亚微乳的稳定【３５１。此外助乳化剂还可以调节乳化剂的ＨＬＢ值，对界面能和乳滴粒径也有一定的影响。３．１．４其他附加剂附加剂用于调节生理环境所需的ｐＨ值和张力。常用盐酸或氢氧化钠调节ｐＨ值至７～８，以便符合生理条件并减少甘油三酯及磷酸的水解。几乎所有静注的亚微乳都应加入等张调节剂，其中以甘油最为常用。再者，还需加入稳定剂，为了防止氧化需加入抗氧剂或还原剂，如维生素Ｅ或抗坏血酸。３．２亚微乳的制备３．２．１高压均质法首先在微热下将药物（也可包括乳化剂）溶解或分散在油相中，乳化剂、等渗调节剂等溶解或分散在水相中，将油、水两相分别加热至７０℃，然后两相混合，在７０～８０℃时用高速搅拌得粗乳，经高压均质机乳化，即得亚微乳，调节ｐＨ值，过滤除去大粒子，分装，热压灭菌，即得。如药物或其他成分易于氧化，则上述所有操作均在氮气氛围下进行。如有成分对热不稳定，则采用无菌操作。当粗乳通过高压阀时，由于高压作用和速度的变化产生空穴力。分散相受空穴产生的震波的影响，粗粒子被分散，粗乳重复通过阀门，继续减小粒径直至平衡为止。该方法制备工艺简单，适合大工业生产。３．２．２超声波乳匀法超声波乳匀法依靠超声波能的短脉冲波分散粒子，可使粗乳分散。岳鹏飞【３６】等先将葛根素磷脂复合物制备成粗乳，粗乳再经５００Ｗ超声（室温且充氮气保护）适当时间，然后加注射用水稀释至Ｕ１００ｍＬ，充氮熔封于安瓿，流通蒸汽灭菌即得葛根素静注亚微乳。所得亚微乳平均粒径在（２２８．２３４－０．５７）ａｍ；３批乳剂样品在室温下放置４个月，ｐＨ值、包封率、粒径大小及ｚｅｔａ电位均无显著性变化。该方法的缺点是单位产量低，不适用于大批量生产。３．２．３微射流法微射流技术是在高压下使两股液流互相撞击而使粗乳分散。粗乳通过有一系列瓷片的通道系统的对流室中，分成两股，然后高速合并，在该过程中粗粒子变成了细小粒子，通常需要反复几次操作才能达到要求的粒径。３．２．４ＳｏｌＥｍｕｌ技术本世纪初，ＭｕｌｌｅｒＲＨ掣３７】研制开发了ｓｏｌＥｍｕｌ技术，即将难溶性药物以微粉或是纳米晶体表面活性剂溶液的形式加入到空白乳剂中，通过多次高压均质作用，使药物晶体溶解于磷脂中，得到含药亚微乳。通过这种技术，７第一章文献综述布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价足够量的亲脂性药物可以结合到脂肪乳的亲脂核内或插入油水界面的乳化膜。但这种方法制得的脂肪乳目前仅限用于注射给药。３．３亚微乳的应用静脉注射亚微乳作为给药载体，不仅能减少药物的不良反应，还能增大药物的溶解度、增强药物的靶向性及缓释效应，提高临床疗效。较多的将其作为抗肿瘤药物及抗菌抗病毒药物的载体，如紫杉醇亚微乳、多烯紫杉醇亚微，Ｌｔ３引、两性霉素亚微乳等。作为药物载体，在给药的同时，静脉注射亚微乳还能为病人提供营养和补充体力。目前，亚微乳在作为中药挥发油及水难溶性药物的静脉给药载体中已表现出较为明显的优势，引起了广大医药工作者的关注，临床上已有多种药物以亚微乳作为给药载体研制出新的静脉给药乳剂，如薏茌油亚微乳、鸦胆子油亚微，Ｌｔ３９１、苗药大果木姜子油静脉亚微乳【柏】、地西泮亚微，Ｌｔ４１１等。随着对亚微乳的进一步深入研究，亚微乳的应用将有更广阔的前景。亚微乳的应用技术正日益成熟，粒径、灭菌、稳定性三大问题已基本得到解决，脂肪乳的表面修饰技术使延长其体循环时间成为可能。ＳｏｌＥｍｕｌ技术的出现给油水两相都难溶的药物带来了希望。静脉注射亚微乳已呈现出巨大的开发潜力和诱人的研究前景，随着静脉注射亚微乳研究的不断深入与发展，该剂型必将在今后的临床应用中展现其独特的疗效价值。４本研究的意义与目的布洛芬（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ，Ｉｂｕ）为常用非甾体抗炎药（ＮＳＡＩＤｓ），通过抑制前列腺素的合成发挥解热镇痛抗炎作用，临床上广泛用于风湿性关节炎等疾病。但是，由于布洛芬分子上带有的羧基，长期用药易引起不良反应，主要为胃肠道副作用，如消化不良、胃溃疡、胃出血，少量伴有肾损伤。通过酯化反应将羧基保护起来是减小胃肠道刺激的有效方法之一。丹皮酚具有抑菌抗炎、解热镇痛、降压利尿、抗凝血、抗过敏、增强免疫功能等作用。丹皮酚可以抑制某些炎症前因子，包括：ＴＮＦ．Ｑ、Ｌ．１Ｂ、Ｌ．６及炎性物质ＰＧＥ２水平的升高，并抑制ＮＯ的产生和ＣＯＸ．２、ＮＯＳ蛋白表达水平的升高，还可以显著性地降低大鼠炎症部位升高的髓过氧化物酶活性，抑制ＮＣ浸润，抗炎特点有别于非甾体类药物【４２，４３１。丹皮酚熔点低、易挥发，室温放置稳定性较差，有必要将其进行结构修饰。苏州大学药学院药物化学教研室利用丹皮酚结构中含８布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第一章文献综述有酚羟基的特点，将其与布洛芬偶联，制得布洛芬．丹皮酚偶合物（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ－ｐａｅｏｎｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＩＰＣ），合成路线如图ｌ＿４所示。该偶合物是一种协同前药，进入体内后，在酶的作用下经过水解反应释放出原型药物，即布洛芬和丹皮酚，协同产生解热镇痛抗炎作用Ｍ，可有效降低给药剂量；同时，布洛芬与丹皮酚偶合后掩蔽了布洛芬中的羧基，降低了布洛芬对胃肠道的刺激，并利用丹皮酚的抗氧化作用提高对胃肠道的保护作用。３ＲＣＯＯＨ—————二◆ＲＣＯＣｌ—————＋吡啶ＨＳＯＣｌ，ＰａｅＯＣＨ３ＰａｅＲ＝（≥ｈ肛∥一ｌｂｕＩ…ＯＣＨ３ＩＰＣ呲◇ＣＯＲＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２图１＿４布洛芬．丹皮酚偶合物（ＩＰＣ）的合成路线综上所述，ＩＰＣ有可能成为具有一定潜力的非甾体抗炎类前药。故本文首先研究了ＩＰＣ的理化性质，包括溶解度、油水分配系数和体内外稳定性。其次，制备和评价了可供静脉注射的ＩＰＣ亚微乳，并考察了其肠吸收和药动学特征。最后，通过二甲苯致小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法评价了ＩＰＣ的抗炎镇痛活性，并对安全性进行了初步考察。９第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬坍皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究药物的物理化学性质尤其是溶解度和油水分配系数对其生物药剂学影响很大。本章对布洛芬－丹皮酚偶合物（ＩＰＣ）在不同ｐＨ条件下的平衡溶解度及油水分配系数进行了测定。另外，由于ＩＰＣ是一种酯类前药，通常以体内降解释放出原型药物的方式发挥作用，其稳定性对药效具有重要影响。故对ＩＰＣ在不同ｐＨ条件和大鼠血浆中的稳定性进行了考察，以便为其进一步研究提供依据。ｌ仪器与试剂１．１仪器恒温振荡器（ＳＨＺ－８２），金坛市富华仪器有限公司；数显ｐＨ计（ＰＨＳ－３ＴＣ），上海天达仪器有限公司；离心机（ＴＧＬ－１６Ｂ），上海安亭科学仪器厂；药物光照实验箱（ＹＧｌ２０），上海恒谊制药有限公司；紫外可见分光光度计（ＵＶ－２４０１），日本岛津公司；高效液相色谱仪（ＬＣ－２０ＡＤ），日本岛津公司。１．２试剂布洛芬坍皮酚偶合物（纯度９９％），苏州大学药学院药物化学教研室提供；布洛芬（纯度大于９８．５％，批号：０８０４０１０），苏州第四制药厂有限公司；丹皮酚（纯度９９％，批号：２００７０４１３），西安天一生物技术有限公司；甲醇，冰乙酸，磷酸，盐酸，柠檬酸，柠檬酸三钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，甘氨酸，氢氧化钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。２实验方法２．１ＩＰＣ、Ｉｂｕ、Ｐａｅ的ＨＰＬＣ分析方法建立２．１．１ＵＶ吸收波长的选择分别称取ＩＰＣ、Ｉｂｕ、Ｐａｅ适量，甲醇溶解，在２００－６００ｎｌｎ范围内扫描，以甲醇作空白。ＩＰＣ的紫外特征吸收波长为２６７和２２０ｎｍ，Ｉｂｕ的紫外特征吸收波长为２２０ｎｌｎ，Ｐａｅ的紫外特征吸收波长为２７３和２２８ｎｌｎ。为了在同一条件下同时测定ＩＰＣ、Ｉｂｕ和Ｐａｅ，故选取２２５ｎｍ作为测定波长。２．１．２ＨＰＬＣ色谱条件ＩＰＣ和Ｉｂｕ的ＨＰＬＣ色谱条件：色谱柱，Ｗａｔｅｒｓ５Ｃ１８－ＡＲ一１１（５ｇｍ，４．６ｘ１５０ｒｎｉｎ，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相，甲醇－１．５％醋酸水（７７：２３）；检测波长，２２５ｎｌｎ；流速，１．０ｍＬ·ｍｉｎｑ；柱温，３５℃。在该色谱条件下，可以同时１０布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬一丹皮酚偶合的理化性质及稳定性研究测定ＩＰＣ（砟＝１２．３ｍｉｎ）和Ｉｂｕ（瓦＝５．１Ｉｌｌｉｎ）。Ｐａｅ的ＨＰＬＣ色谱条件：色谱柱，Ｗａｔｅｒｓ５Ｃ１８－ＡＲ—ＩＩ（５ｌａｉｎ，４．６ｘ１５０ｍｍ，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相，甲醇－１．５％醋酸水（６０：４０）；检测波长，２２５ｎｍ；流速，１．ＯｍＬ·ｍｉｎ。１；柱温，３５℃。在上述色谱条件下，Ｐａｅ的保留时间（Ｔｒ）为５．８ｍｌ‘ｎ。２．１．３标准曲线的绘制精密称取ＩＰＣ２５．４ｍｇ，置于２５ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为１０１６ｌａｇ·ｍＬ－１的贮备液。精密量取贮备液适量，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为２．４２、７．３２、１２．１９、４８．７７、１０１．８、２０３．６ｌａｇ·ｍＥ－１的系列标准溶液，进样２０ｌａＬ，高效液相色谱仪分析。以ＩＰＣ浓度ｃ（１ａｇ·ｍＬｑ）为横坐标，峰面积Ａ为纵坐标进行线性回归，得ＩＰＣ的线性回归方程为：Ａ＝５１４５６Ｃ一１０３４３９，ｒ＝０．９９９２，表明ＩＰＣ在２．４２－２０３．６ｌａｇ·ｍＬ－ｌ内呈良好线性关系。精密称取Ｉｂｕ１０．３０４ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇将药物溶解，稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为１０３０．４ｌａｇ·ｎｉＬ－１的贮备液。精密量取贮备液适量，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为２．０６、１０．３０４、５１．５２、１０３．０４、２０６．０８、５１５．２ｌａｇ·训Ｌ－ｌ的系列标准溶液，进样２０ｐＬ，高效液相色谱仪分析。以Ｉｂｕ浓度Ｃ（１ａｇ·ｍＬ－１）为横坐标，峰面积Ａ为纵坐标，进行线性回归得如下方程：Ａ＝１３５９．１Ｃ＋１６９３２，ｒ＝０．９９８３，表明Ｉｂｕ在２．０６－５１５．２ｌａｇ·ｍＬ－１内呈良好线性关系。精密称取Ｐａｅ１０．２５２ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇将药物溶解，稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为１０２５。２Ｐ．ｇ·ｍＥ－１的贮备液。精密量取贮备液适量，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为２．０５、１０．２５２、５１．２６、１０２．５２、２０５．０４、５１２．６肛ｇ·ｍＥ－１的系列标准溶液，进样２０ｐＬ，高效液相色谱仪分析。以Ｐａｅ浓度Ｃ（１ａｇ·ｍＬ－１）为横坐标，峰面积Ａ为纵坐标进行线性回归，得Ｐａｅ的线性回归方程为：Ａ＝７８３４２Ｃ＋２８１４０，ｒ＝０．９９９９，表明Ｐａｅ在２．０５。５１２．６ｕｇ·ｌＩｌ】Ｌ．１内呈良好线性关系。２．１．４色谱行为精密称取ＩＰＣ２４．３８５ｍｇ，置于２５ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇将药物溶解，稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为９７５ｌａｇ·ｍＬｑ的贮备液。精密量取贮备液Ｏ．５ｍＬ，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为４８．７７ｌａｇ·ｍＬ。１的ＩＰＣ溶液，进样２０“Ｌ，高效液相色谱仪分析。．色谱图见图２－１。第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价精密称取Ｉｂｕ１０．３０４ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇将药物溶解，稀ｍＬ，释至刻度，摇匀，得质量浓度为１０３０．４ｇｇ·ｍＬ。１的贮备液。精密量取贮备液１置１０ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为１０３．０４ｇｇ·ｍＬ以的Ｉｂｕ溶液，进样２０９Ｌ，高效液相色谱仪分析。色谱图见图２－１。图２．１ＩＰＣ与Ｉｂｕ的ＨＰＬＣ色谱图①Ｉｂｕ甲醇溶液色谱图②ＩＰＣ甲醇溶液色谱图③Ｉｂｕ与ＩＰＣ甲醇溶液色谱图结果表明，甲醇溶液中的杂质不干扰ＩＰＣ及Ｉｂｕ成分的测定，峰形良好。精密称取Ｐａｅ２．５６２ｍｇ，置于２５ｍＬ量瓶中，加入适量甲醇将药物溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为１０２．５ｇｇ·ｍＬ。的贮备液。精密量取贮备液１ｍＬ，置１０ｍＬ量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为１０．２５Ｐｇ·ｍＬ。１的Ｐａｅ溶液，进样２０９Ｌ，高效液相色谱仪分析。Ｐａｅ的色谱图见图２．２。’１２布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬一丹皮酚偶合的理化性质及稳定性研究０．０１．０２．０３．０４．０５．０６．０７．０ｍｉｎ图２．２Ｐａｃ的ＨＰＬＣ色谱图结果表明，在该色谱条件下，未见杂质干扰Ｐａｅ成分的测定，峰形良好，专属性高。２．１．５精密度考察配制ＩＰＣ低、中、高三种浓度的甲醇溶液各３份，于早、中、晚，及第一天、第二天、第三天分别测定。计算得ＩＰＣ方法日内精密度ＲＳＤ为１．９４％，日间精密度ＲＳＤ为２．３４％，表明该分析方法精密度良好。配制Ｉｂｕ低、中、高三种浓度的甲醇溶液各３份，于早、中、晚，及第一天、第二天、第三天分别测定。计算得Ｉｂｕ方法日内精密度ＲＳＤ为１．８７％，日间精密度ＲＳＤ为２．９８％，表明该分析方法精密度良好。配制Ｐａｅ低、中、高三种浓度的甲醇溶液各３份，于早、中、晚，及第一天、第二天、第三天分别测定。计算得Ｐａｅ方法日内精密度ＲＳＤ为２．０５％，日间精密度ＲＳＤ为２．６８％，表明该分析方法精密度良好。２．１．６加样回收率的测定精密量取已知含量的ＩＰＣ，加入其低、中、高三种浓度的样品适量，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取２０“Ｌ进样，记录峰面积。测得加样回收率，结果见表２．１。１３第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价表２—１Ｐｃ的加样回收率原有量（Ｉｎｇ）０．９７６０．９７６０．９７６０．９７６０．９７６０．９７６０．９７６ＪＪＩＡ．１（ｍｇ）０．４８８０．４８８０．４８８０．９７６Ｏ．９７６０．９７６１．９５２１．９５２１．９５２实际量（ｍｇ）１．４４１回收率（％）９８．４９９．３９８．９９９．１平均回收率（％）ＲｓＤ（％）１．４５４１．４４８１．９３４１．９７９１．９２５２．９１０２．９６３２．９４３９９·６１０１．４９８．６９９．４１０１．２１００．５ｌ·１１０．９７６０．９７６同法测定Ｉｂｕ和Ｐａｅ的加样回收率，结果分别见表２－２，表２－３。表２－２Ｉｂｕ的加样回收率原有量（ｎ唱）１．０３０ＪＪｌ／Ｘ，ｌ（ｍｇ）０．５１５０．５１５０．５１５１．０３０１．０３０实际量（ｍｇ）１．５５６１．５２２１．５３４回收率（％）１００．７平均回收率（％）ＲＳＤ（％）１．０３０１．０３０１．０３０９８．５９９．３１００．７１００·４２．０７４２．１０７１．０３０１．０３０１．０３０１０２．３１０１．５９８．８１００．９１００．７１．２６１．０３０２．０６１‘２．０６１２．０９ｌ３．０５４３．１２０．３．１１３１．０３０１．０３０２．０６１表２－３Ｐａｅ的加样回收率原有量（Ⅱ唱）１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５１．０２５加入量（ｍｇ）０．５１３Ｏ．５１３Ｏ．５１３１．０２５１．０２５１．０２５２．０５２．０５２．０５实际量（ｎ唱）１．５６４１．５１５１．５２７１．９９７２．１０１２．０５８３．０１７３．１０３３．１４９．回收率（％）１０１．７９８．５９９．３９７．４平均回收率（％）ＲＳＤ（％）１００·２１０２．５１００．４９８．１１００．９１０２．４ｌ·９０１４布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬一丹皮酚偶合的理化性质及稳定性研究２．２平衡溶解度的测定方法将过量的ＩＰＣ置于１０ｍＬ具塞玻璃试管中，分别加入水、ｐＨ值分别为１．２、２．０、３．Ｏ、４．０、５．０、６．０、６．８、７．０、７．４、８．０、９．０、１０．０的磷酸盐缓冲液２ｍＬ，３７℃摇床振摇，分别在２４，９６ｈ取上清液３００ｇＬ，离心取２０此注入高效液相色谱仪，记录峰面积，代入标准曲线计算ＩＰＣ在不同ｐＨ缓冲溶液中的平衡溶解度【４５１。２．３表观油水分配系数的测定方法将５ｍＬ正辛醇分别和１５ｍＬ蒸馏水，ｐＨ值１．２、２．Ｏ、３．０、４．０、５．０、６．０、６．８、７．０、７．４、８．０、９．０、１０．０缓冲溶液混合，在振荡器上于３７℃振荡２４ｈ，令其相互饱和，在分液漏斗中静置分层后，分离两相，将两相界面附近的溶剂弃去，分别保存备用【４５１。精密称取ＩＰＣ１３．９７ｍｇ溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为１３９７“ｇ·ｍＬ以的溶液（ＩＰＣ的质量浓度为ｐｏ），取该溶液Ｏ．５ｍＬ于１０ｍＬ具塞试管中，再加入１．５ｍＬ正辛醇，分别加入２ｍＬ正辛醇饱和的水、ｐＨ值分别为１．２、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、６．８、７．０、７．４、８．０、９．０、１０．０的磷酸盐缓冲溶液，３７℃摇床振摇７２ｈ，离心，取下层水相２０此注入高效液相色谱仪，记录峰面积。精密称取Ｉｂｕ１０．０４ｍｇ溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为１００４ｐ．ｇ·ｍＬＪ的溶液；精密称取Ｐａｃ１１．００ｍｇ溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为１１００ｇｇ·ｍＬ以的溶液，根据上面方法测定Ｉｂｕ和Ｐａｃ的表观油水分配系数。２．４ＩＰＣ的初步稳定性实验将样品置于称量瓶中，分别置于高温（６０℃）、高湿（９０４－５％，２５。Ｃ）和强光（４５００４－５００Ｉｘ）条件下，．进行影响因素试验。于第五天和第十天取样测定，观察外观变化，ＨＰＬＣ测定其浓度，并计算药物含量，与试验前进行比较［４６１。２．５ＩＰＣ在不同ｐＨ值缓冲溶液中的稳定性在３７℃气浴，ｐＨ１．２～１０的缓冲溶液中进行ＩＰＣ的水解动力学考察。配制十二个ｐＨ值的缓冲液（１．２、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、６．８、７．０、７．４、８．０、９．０、１０．０，浓度Ｏ．０５ｍｏｌ·Ｌ以），分别加入适量ＫＣＩ调整各溶液的离子强度为０．２。精密移取２０ＨＬＩＰＣ甲醇贮备液（１０ｍｇ·ｍＬｄ），加至１０ｍＬ不同ｐＨ值的缓冲溶液，于预定时间（０、１．５、３、６、１２、２４ｈ）取样１００ｐＬ。在样品中加入１００止甲醇，涡旋，离，凸，（１００００ｒ·ｍｉｎ～×１０ｍｉｎ），取上清液，．ＨＰＬＣ法测定ＩＰＣ浓度。以剩余药物浓度的自然对数值对时间做图，一级速率常数（屯曲由斜率求得，半衰期由１５第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价ｔｌ／２＝０．６９３／ｋｏｂ，求得【４７１。总的水解速率公式为：－ｄＣ／ｄｔ＝‰×Ｃ。２．６ＩＰＣ在血浆中的稳定性经ＨＰＬＣ验证，ＩＰＣ在一定条件下的水解产物为Ｉｂｕ，由于Ｉｂｕ在血浆中相对稳定，因此我们通过测定ＩＰＣ在血浆中释放Ｉｂｕ的速度来间接测定ＩＰＣ在血浆中的稳定性。２．６．１血浆中ＩｂｕＦＩＰＬＣ分析方法的建立色谱条件：色谱柱，Ｗａｔｅｒｓ５Ｃ１８－ＡＲ—Ｉｆ（５ｔｉｍ，４．６ｘ１５０ｎｌｍ，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相，甲醇一１．５％醋酸水（７７－２３）；检测波长，２２５ｎｌｎ；流速，１．０ｍＬ·ｍｉｎ－ｌ；柱温，３５℃。在上述色谱条件下，可以同时测定ＩＰＣ和Ｉｂｕ，ＩＰＣ的保留时间为１２．３１ｒａｉｎ，Ｉｂｕ的保留时间为５．１４ｒａｉｎ。血装样品的预处理：精密吸取血浆样品２００“Ｌ，立即用４倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋，离一Ｉ二，（１００００ｒ·ｎｌｉＩｌ－１ｘｌＯｍｉｎ），取上清液，Ｉ－ＩＰＬＣ法测定ＩＰＣ浓度，并计算降解速率常数。标准曲线的绘制：分别精密移取２００Ｉ．ｔＬ空白血浆样品，置于１．５ｍＬ离心管中，依次加入Ｉｂｕ原料药系列溶液配制成浓度为０．５５，２．２０，５．５０，１０．９９，２１．９７，２７．４７，５４．９４ｌａｇ·ｍＬ－１的血浆样品。按“血浆样品的预处理＂项下方法进行样品处理进样测定，以Ｉｂｕ血药浓度Ｃ为横坐标，Ｉｂｕ峰面积为纵坐标，得标准曲线方程为。．５２．１５８＋１５７３７Ｃ，ｆ＝０．９９９４，线性范围：０．５５。５４．９５ｌｘｇ·ｍＥ－１。方法回收率考察：精密移取２００“Ｌ空白血浆样品，置于１０ｍＬ具塞试管中，分别加入ｌｂｕ原料药系列溶液配制成浓度为１．３７，６．８７，２７．４７肛ｇ·ｍＬ－Ｉ的血浆样品，每一浓度配制三份，按“血浆样品的预处理＂项下方法进行样品处理，由标准曲线计算测定值，将测定值除以理论值，即为本方法的回收率。结果见表２－４。表２－４血浆中方法回收率考察结果（；衄，ｎ＝３）方法精密度：精密移取２００¨Ｌ空白血浆样品数份，置于１．５ｍＬ离心管中，分别加入Ｉｂｕ原料药系列溶液配制成浓度为１．３７，６．８７，２７．４７ｐｇ·ｍ一的血浆样品，按“血浆样品的预处理＂项下方法进行样品处理。一天内３个不同的时间测定样１６布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬一丹皮酚偶合的理化性质及稳定性研究品，低、中、高三个浓度样品的日内精密度分别为１．８２％、１．２３％、２．３７％。同法连续测定３天，低、中、高三个浓度样品的日间精密度分别为３．５６％、１．２９％、４．７６％。２．６．２ＩＰＣ在血浆中的降解动力学方法【４８】取２０ｇＬＩＰＣ甲醇贮备液（１０ｍｇ·ｍＬ以），加至４ｍＬ新鲜大鼠空白血浆（８０％，ｐＨ７．４等渗磷酸盐稀释，３７℃），孵化，分别于不同时间点取样２００ｇＬ，并立即用４倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋，离，１二，（１００００ｒｍｉｆｆｌｘｌ０ｍｉｎ），取上清液，ＨＰＬＣ法测定ＩＰＣ浓度。３结果与讨论３．１平衡溶解度的测定结果ＩＰＣ、Ｉｂｕ和Ｐａｅ在不同ｐＨ缓冲溶液中的平衡溶解度见表２．５。可见，ＩＰＣ的水溶性较差，在水中的溶解度仅为３．３７ｇｇ·ｍＬ～，与Ｉｂｕ（１１０．８７Ｐ．ｇ·ｍＬ＂１）和Ｐａｅ（４６４．５９ｇｇ·ｍＬ‘１）的水中溶解度相比，ＩＰＣ的水溶性明显降低。介质ｐＨ的改变（ｐＨＩ．２－１０．Ｏ）对药物的溶解度影响不大，这可能是由于ＩＰＣ为酯类药物，受ｐＨ影响较小。表２—５ＩＰＣ，Ｉｂｕ，Ｐａｅ在不同ｐＨ缓冲溶液中的平衡溶解度１７第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价３．２表观油水分配系数的测定结果表观油水分配系数是药物的重要理化性质之一，它表示药物的极性或亲水亲油性，可用于预测药物在微乳中油相与水相间的分配。由于ＩＰＣ在水中的溶解度小，脂溶性强，采用摇瓶法测定分配系数时，药物大部分进入油相，水相浓度很小【４９】。将测得的峰面积代入标准曲线计算］ＰＣ的浓度为ｐｗ，按照公式Ｐ＝（Ｐｏ－＇Ｐｗ）／Ｐｗ计算表观油水分配系数。同法计算［ｂｕ和Ｐａｅ的表观油水分配系数，结果见表２－６。结果表明，ＩＰＣ的油水分配系数在ｐＨ２．０－５．０范围内，随着ｐＨ值的上升而增大：在ｐＨ值为９．０和１０．０时达到最大；在其它ｐＨ范围之类水相中检测不到ＩＰＣ。表２－６ＰＣ，Ｉｂｕ，Ｐａｅ在不同ｐＨ值缓冲溶液中表观油水分配系数“Ｊ’：测量不出水溶液中药物含量３．３ＩＰＣ的初步稳定性结果影响因素试验结果显示（见表２－７），ＩＰＣ在高湿和光照条件下放置１０天无显著变化，但在高温条件下发现明显降解的现象（＞ｌＯ％）。表２－７ＩＰＣ的稳定性试验结果（工蛔，ｎ１３）１８布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第二章布洛芬一丹皮酚偶合的理化性质及稳定性研究３．４ＩＰＣ在不同ｐＨ环境中的稳定性结果以剩余药物浓度的自然对数值对时间做图得一条直线，由此可知ＩＰＣ的水解反应符合一级反应动力学方程，由直线斜率可得反应速率常数，从而计算出水解半衰期。ＩＰＣ在不同ｐＨ条件下的降解速率参数和降解速率曲线分别见表２－８和图２－３。如图２－３所示，ＩＰＣ在ｐＨ３．０－４．０的酸性缓冲溶液中水解最慢，而在ｐＨ５．０的弱酸性缓冲溶液中水解速度加快；且在ｐＨ７．０－１０．０条件下水解速率进一步上升。可见，ＩＰＣ在酸性条件下的稳定性高于碱性条件。图２－３ＩＰＣ在３７℃下不同缓冲溶液中的ｐＨ超率曲线（ｘ：ｂ－ｓ，ｎ－－３）表２－８ｐＨ催ｉ．对ＩＰＣ降解速率的影响（ｘ蜘，ｎ－－３）如表２．８所示，ＩＰＣ在ｐＨ５．０的弱酸性缓冲盐溶液中‰撕值略高。这可能是由１９第二章布洛芬一丹皮酚偶合物的理化性质及稳定性研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价于在弱酸条件下催化ＩＰＣ水解的作用更强，或因混悬的过量药物持续溶解所致，而ＩＰＣ在弱酸性水相体系中的溶解度稍低，导致残留药量较少，表现为‰撕值偏大。３．５口Ｃ在血浆中的稳定性试验结果以残留药物浓度的自然对数值对时间做图，得曲线方程ｌｎＣ＝－０．３８９２ｔ＋５．１３２，ｒ；０．９８８。由斜率计算ＩＰＣ在８０％血浆中的水解速率常数，并求得其水解半衰期（ｔｖ２＝１．７８ｍｉｎ）。同时检测ＩＰＣ转化为母体Ｉｂｕ的量，见图２＿４。ＩＰＣ吸收进入体内后，迅速转化为原型药物产生而发挥药效。，可见，ＩＰＣ的血浆水解半衰期为１．７８ｍｉｎ，在大鼠血浆中可迅速还原为母体药物Ｉｂｕ和Ｐａｅ。加∞∞∞加吠／Ｓ—叻加ＯＵｌＯＺＵ３ＵＴｉｍｅ／ｒａｉｎ图２４ＩＰＣ在血浆中的稳定性（ｘ：Ｊ：ｓ，ｎ－－３）４本章小结ＩＰＣ在水中溶解度很低，属于水难溶性药物，溶解度无ｐＨ依赖性。初步稳定性实验结果表明，ＩＰＣ的稳定性受高温条件影响，但与高湿和强光照射无关。在不同ｐＨ值缓冲溶液中的稳定性实验结果表明，ＩＰＣ在ｐＨ３．旷４．０的酸性缓冲溶液中水解最慢，在碱性条件下水解加快。血浆中的稳定性实验结果，ＩＰＣ在血浆中的降解曲线方程为ｌｎＣ＝－０．３８９２ｔ＋５．１３２，ｒ＝０．９８８：降解半衰期为１．７８ｍｉｌｌ，ｌ‰。值为旬．４０９８。与ＩＰＣ在不同ｐＨ值的缓冲溶液中的酸碱催化的降解机制不同，血浆中存在丰富的水解酶，ＩＰＣ在大鼠血浆中可迅速还原为母体药物布洛芬和丹皮酚，从而发挥协同药理作用。布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制备及肠吸收评价第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制备及肠吸收评价前期研究结果显示，ＩＰＣ的水中溶解度差，且在偏酸性环境中容易发生水解。而Ｏ／Ｗ型亚微乳可用于提高易水解药物的稳定性，并促进药物的生物膜通透性。所以，本文参考经典静注脂肪乳的处方【３６，４０，ＳＯｌ，采用高压均质机制备了Ｏ／Ｗ型ＩＰＣ亚微乳，并以药物含量和平均粒径为指标进行了评价。评价药物肠道吸收的方法主要有离体法、在体法和体内法，其中因在体法不损伤研究部位的淋巴循环和血液循环系统，且操作方法简单，得到广泛的应用。此外，由于单向灌流模型吸收速率稳定，与人体有良好的相关性，而被国外普遍采用［５１，５２１。为了探讨ＩＰＣ的口服给药可能性，本文采用在体肠段单向灌流质量法，进行了大鼠各肠段中的吸收情况评价研究，并对吸收机制进行了初步的探讨。１仪器、试剂及动物１．１仪器高压均质机（ＡＨｌ００Ｄ），上海ＡＴＳ工业系统有限公司；多点式加热搅拌器（ＴＲｌ０Ｐｏｗｅｒ）和高速剪切机（ＩＫＡＴ１８），广州仪科实验室技术有限公司；激光粒度分析仪（ＨＰＰ５００１），英国马尔文公司；离心机（ＴＧＬ．１６Ｂ），上海安亭科学仪器厂；恒流泵（ＨＬ．１型），上海青浦沪西仪器厂；电热恒温水浴锅，北京精科华瑞仪器有限公司；高效液相色谱仪（ＬＣ．２０ＡＤ），日本岛津公司；ＭＥ２１５Ｓ型分析天平，苏州泓成电子科技有限公司。１．２试剂布洛芬．丹皮酚偶合物（纯度９９％），苏州大学药物化学教研室提供；布洛芬（纯度大于９８．５％，批号：０８０４０１０），苏州第四制药厂有限公司；大豆油（供注射用），龙游县田雨山大豆油开发有限公司；大豆磷脂（供注射用，纯度９５％，批号：０８０５１６），上海太伟药业股份有限公司；Ｋｒｅｂ－Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ营养液（简称Ｋ氏液）自制，处方组成：氯化钠７．８ｇ，氯化钾０．３５ｇ，碳酸氢钠１．３７ｇ，氯化镁０．２２ｇ，磷酸二氢钠Ｏ．２２ｇ，葡萄糖１．４ｇ，加水至１０００ｍＬ。供试药液：取适量ＩＰＣ亚微乳，用Ｋ氏液稀释所得；其它试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。１．３实验动物２１第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制备及肠吸收评价布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价ＳＤ大鼠，体重（２５０４－２０）ｇ，雄性，苏州大学医学院实验动物中心提供，清洁级【许可证号：ＳＹＸＫ（苏）２００９—００５７］。２实验方法２．１亚微乳处方主药（ＩＰＣ或Ｉｂｕ）为１．Ｏｇ，注射用大豆油为１０ｇ，大豆磷脂为１．２ｇ，ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８为０．４ｇ，甘油为２．５ｇ，加水至１００ｍＬ。２．２亚微乳制备方法在装有ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８和甘油的烧杯中加入２０ｍＬ的注射用水在７０℃水浴上搅拌，使ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８和甘油完全溶于水中保温作为水相；将主药、注射用大豆油和大豆磷脂于烧杯中在７０℃水浴搅拌均匀，使其充分溶解并保温作为油相，用高速剪切机进行搅拌，边搅拌边加入水相得到乳白色初乳，将初乳加水至１００ｍＬ，用高压乳匀机在平均压力为８００ｂａｒ的条件下乳化４次取出得乳白色的乳剂。分别制备空白亚微乳、Ｉｂｕ亚微乳及ＩＰＣ亚微乳各三份。２．３亚微乳含量测定方法２．３．１ＨＰＬＣ分析方法的建立采用第二章２．１项下ＨＰＬＣ分析方法测定样品含量。２．３．２样品处理方法取亚微乳Ｏ．１ｍＬ至１０ｍＬ容量瓶，加入甲醇定容，取一定量溶液至１．５ｍＬ离心管中，１００００ｒ．ｍｉｎ＂１离心１０ｍｉｎ，取上清液２０此进行ＨＰＬＣ分析。２．３．３色谱行为空白亚微乳、Ｉｂｕ亚微乳、ＩＰＣ亚微乳分别按“２．３．２＂项下方法处理，ＨＰＬＣ色谱图如图３．１所示。由图３．１所示，亚微乳中的成分对药物的测定没有影响。布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制备及肠吸收评价图３．１亚微乳的色谱图①空白亚微乳色谱图；②Ｉｂｕ亚微乳色谱图③ＩＰＣ亚微乳色谱图２．４大鼠在体肠吸收单向灌流法实验方纠５１，５２．５３】取自由饮水条件下禁食１８￣２４ｈ的大鼠，腹腔注射３０ｍｇ·ｋｇｄ的戊巴比妥钠水溶液，麻醉后的大鼠固定于鼠台上，底部用白炽灯保温。沿腹中线切开腹部约３ｃｍ，分离出需要考察的部位，取约１０ｃｍ于两端切口后插管，结扎，伤口处用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，并注意随时更换，用白炽灯照射保温。用３７℃恒温的生理盐水以１．０ｍＬ·ｒａｉｎ＂１的速度将肠内容物冲洗干净，再用空气将生理盐水排空。取预热至３７℃的供试药液一定量，先以０．２ｍＬ·ｍｉｎ＂１的速度灌流１０ｒａｉｎ，排尽管内气泡。铲”进口处用已知重量的装有供试液的小瓶进行灌流，流速０．２ｍＬ·ｒａｉｎ＂１，开始计时，每隔１５ｍｉｎ在出口处用另一已知重量的小瓶收集一次（同时迅速更换下一个供试液小瓶和收集液小瓶），称量此时供试液小瓶和收集液小瓶的重量，计算供试液小瓶减少的重量和收集液小瓶增加的重量，就是灌入和收集的供试液质量。实验共收集５次流出液。实验结束处死大鼠后，测量考察肠段长度及横切面周长。２．５肠灌流液样ｇ口ＨＰＬＣ分析方法的建立２．５．１ＨＰＬＣ色谱条件色谱柱，Ｗａｔｅｒｓ５Ｃ１８．ＡＲ－ＩＩ（５ｔｔｒｎ，４．６ｘ１５０ｒｎｍ，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相，甲醇．１．５％醋酸水（７７：２３）；检测波长，２２５ｒｉｌｌｌ；流速，１．０ｍＬ－ｒａｉｎ～；柱温，３５℃；进样量，２０ｐＬ。Ｉｂｕ的保留时间约为５．０２ｒａｉｎ，ＩＰＣ的保留时间约为１２．２１ｍｉｎ。２．５．２标准曲线的绘制精密称取ＩＰＣ２７．７６ｍｇ，置于２５ｍＬ容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容，取５ｍＬ至１０ｍＬ容量瓶中，稀释至刻度，作为储备液。分别精密量取适量储备液置于１０ｍＬ容量瓶中，加Ｋ氏液适量，超声，用Ｋ氏液定容，得系列浓度ＩＰＣ溶液（１．１１－５５５．２）ｇｇ·ｍＬ～，Ｏ．４５ｐｍ微孔滤膜过滤，进样２０第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制各及肠吸收评价布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价“Ｌ，计算ＩＰＣ的峰面积。以峰面积（Ａ）对质量浓度（Ｃ）线性回归，得标准曲线方程Ａ＝３３５７９Ｃ＋１９７０２３，ｒ＝０．９９９８。表明ＩＰＣ在１．１１～５５５．２ｐｇ·ｍＬ。１质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。２．５．３精密度及回收率ＩＰＣ高（２２２．０８ｐｇ·ｍＬ。１）、中（１１１．０４ｐｇ一．ｍＥ。１）、低（５５．５２Ｉ．ｔｇ·ｍＥｄ）３种质量浓度样品的回收率均大子９８％（ｎ＿３）。日内、日间精密度均小于５％（ｎ＝３）。２．６肠灌流液样品的处理方法取供试液或收集液１２００“Ｌ，加甲醇６００ｐＬ，２０００ｒｍｉｎ以涡旋３０ｓ，１００００ｒ·ｍｉｎ＂１离，ｔ］，ｌＯｍｉｎ，取上清液６００斗Ｌ，０．４５ｐｍ微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下进行分析，记录峰面积，根据标准曲线方程计算供试液和收集液中药物浓度。２．７肠灌流液样品数据处理方法采用质量法计算净水流量（ＮＷＦ，ｍＬ·ｃｍ＂１），药物吸收分数（民％·ｃｍ＂１），表观吸收系数（尸哪，ｍＬ·ｍｉｎ＂１），吸收速率常数‰ｒａｉｎ＂１），计算公式如下：净水流量（ＮｗＦ，ｍＬ．ｃ酊１）．ＮＷＦ＝毕药物吸收分数限，％。锄ｄ）：ｃ＝（１一导×势／三表观吸收系数俨狮，ｔ，儿‘ｍｉｎ．１）：％＝盖×ｌｎ（％×鲁）吸收速率常数‰耐¨口＝（１－％×静×等式中，Ｃｉｎ和ＣｏＩｌｔ分别为进口、出口灌流液浓度；ＱｉＩＩ和Ｑｏ眦分别为进口、出口灌流液体积；Ｑ为灌流速度（０．２～０．３ｍＬ·ｍｉｎ＂１）；Ｖ为灌流肠段体积；ｒ为灌流肠段横切面内径。２．８统计学方法统计数据以；姆表示，数据分析采用ＳＰＳＳｌ７．０软件，组间差异比较采用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），当尸＜０．０５时判定具有显著性差异，组间差异的比较采用ｔ检验。３结果与讨论３．１亚微乳的粒径和分布２４在室温条件下，将０．１ｍＬ的ＩＰＣ（或Ｉｂｕ）亚微乳置于安瓿中，加入３．９ｍＬ水稀释，摇匀，即得。将稀释后的亚微乳置激光粒度分析仪的样品吸收池，测定亚微乳的粒径大小和分布（结果见表３—１，图３－２，３—３，３－４）。图３－２空白亚微乳粒径分布图３－３Ｉｂｕ亚微乳粒径分布。图３．４ＩＰＣ亚微乳粒径分布２５第三章布洛芬一丹皮酚偶合物亚微乳的制各及肠吸收评价布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价３．２亚微乳中含药量的测定ｌｂｕ亚微乳中药物的含量为８．２３ｎａｇ·ｍＬ－Ｉ，ＩＰＣ亚微乳中药物的含量为９．２３ｍｇ·ＩＩｌＬ－１。３．３吸收部位对肠吸收的影响分别取以下肠段：十二指肠，自幽门１ｃｍ处开始；空肠段，自幽门１５ｃｍ处开始；回肠，盲肠上行２０ｃｍ处开始；结肠，紧邻盲肠至直肠；各段均取１０ｃｍ。用药物质量浓度为１０４．３Ｉ．ｔｇ·ｍＬ－１的供试液分别灌流，流速流速０．２＂－＇０．３ｍＬ·ｍｉｌｌ－Ｉ。按“２．３”项下方法操作，测定大鼠不同肠段吸收ＩＰＣ的速率常数和表观吸收系数。考察吸收部位对ＩＰＣ吸收的影响。结果见表３－２。表３－２不同肠段对药物吸收速率的影响（工蛔，ｎ＿５）（ｍＬ‘ｃｍ叶）（％‘ｃｍ－１）（ｃｍ．ｍｉｎ－１）３９．２３－４－８．０５６４６．８６－ａ：５．７５６．４１：ｔ：１．８６１１．８０．＋２．２８８６．９６ｄ：１．３１６．５４．＋－０．６７（ｍｉｎｌ）１０．３９士２．３２１５．１４＋２．３４８１０．１３．＋１．５４９．７３．＋０．７９十二指肠空肠回肠１５．２２．＋４．８８３．１４＂＋３．５１１１．６９．＋５．６０１４．７士５．２２３５．５３．４－４．５６３９．６６士２．４４结肠ａ与其它组比较有显著性差异，Ｐ＜０．０５结果表明，经ＳＰＳＳ方差齐性检验，ＩＰＣ在空肠段的药物吸收速率常数明显高于其它肠段，它们之间存在显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）；十二指肠、回肠、结肠间药物吸收速率常数比较，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。说明ＩＰＣ在全肠道吸收较好，空肠为其特定吸收部位。３．４药物质量浓度对肠吸收的影响将ＩＰＣ亚微乳用Ｋ氏液精密配制ＩＰＣ质量浓度分别为５２．２、１０４．３ｉ２０８．６ｍｇ·ｍＬ－Ｉ的供试液，以十二指肠段为灌流部位，灌流速度０．２＂－－０．３ｍＬ·ｍｉｎ‘１，按“２．６”项下方法操作，测定ＩＰＣ肠吸收的‰和墨，考察灌流液的质量浓度对ＩＰＣ肠吸２６布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第三章布洛芬一丹皮酚偶合物．弧微乳的制各及肠吸收评价收的影响。结果见表３－３。表３－３不同浓度的ＩＰＣ对十二指肠吸收的影响（ｘ：ｋｓ，ｎ－－５）ＮＷＦ／ｘ１０一（ｍＬ·ｃｍ－１）低浓度中浓度高浓度９．９－ａ：６．７１５．２２－－Ｌ４．８８３８．２０－－士７．００Ｆｄ×１０一Ｐ一×１０一（％·ｃｍ叶）４９．３９－ａ：２．４３３９．２３－４－８．０６２９．８６－ａ：７．８５Ｋ０×１０心（ｃｍ·ｍｉｎｌ）１０．５７４－１．７０６．４１４－１．８６４．６７－４－１．９０（ｍｉｎ叶）１５．２６－ａ：２．１７１０．３９－ａ：２．３２６．９４－４－２．５８经ＳＰＳＳ方差齐性检验，低浓度组的吸收速率常数与中、高浓度组之间存在显著性差异（Ｐ＜０．０１）；中，高浓度之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结果表明，随着化合物浓度的升高，吸收速率常数减小。这可能是因为当化合物浓度达到一定值时，肠吸收达到饱和，所以吸收速率常数减小。４本章小结在本研究中的亚微乳处方为注射用微乳的经典处方，适用于多数药物的微乳的制备。制备亚微乳后，ＩＰＣ溶解度达到近１０ｍｇ·ｍＬ－１，所制亚微乳粒径在１００＂２００ｎｌｎ之间分布均匀，基本达到了研究的目的。另外，ＩＰＣ亚微乳也可采用口服给药的方式，以发挥ＩＰＣ作为前药的优势，及降低布洛芬对胃肠道的刺激性，并提高的生物利用度。另外，通过对凰和‰的研究表明，ＩＰＣ在小肠的吸收情况为：空肠＞十二指肠＝回肠＝结肠，空肠的墨和Ｐａｐｐ与其它肠段之间存在显著性统计学差异（Ｐ＞０．０５），说明ＩＰＣ在全肠道吸收良好，空肠是其特定吸收部位。对不同药物浓度的进一步研究发现，ＩＰＣ在小肠的吸收情况为：低浓度＞中浓度＞高浓度，低浓度的砀和‰与中浓度、高浓度组间存在显著性差异（Ｐ＜０．０１），但是中浓度和高浓度之间无显著性差异，即灌流液浓度低时，浓度对吸收有很大影响，当浓度足够大时，浓度的变化对小肠吸收的影响不显著，说明ＩＰＣ的小肠吸收存在高浓度饱和现象。其机理有待进一步探讨。２７第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究药物动力学的研究目的是揭示体内血液中化合物的浓度随时间发生变化的关系，并根据数学模型计算动力学参数，为药效学等实验提供依据。前期研究发现，ＩＰＣ作为一种酯类化合物，在血浆中很快就会降解成原型药物Ｉｂｕ和Ｐａｅ，因此通过测定血浆中原型药物ｒｏｕ的浓度考察ｉＰＣ的体内的药动学过程。本文对ｉＰＣ亚微乳、ｌｂｕ亚微乳和Ｉｂｕ溶液进行了大鼠股静脉插管给药的药动学研究。１仪器、试剂及动物１．１仪器氮吹仪（ＳＣ－２４Ａ），ＮＧＡＯＴ＆Ｄ；涡旋器（ＩｒＡ，Ｓ２），广州仪科实验室技术有限公司；台式离心机（Ａ－１０００），上海安亭科学仪器厂；高效液相色谱仪（ＬＣ－２０ＡＤ），日本岛津公司。１．２试剂Ｉｂｕ亚微乳，ＩＰＣ亚微乳，按照第三章２．２制备方法自制；肝素，国药集团化学试剂有限公司；乙醚（ＡＲ），南京化学试剂有限公司。１．３实验动物ＳＤ大鼠，体重（２５０４－２０）ｇ，雄性，苏卅Ｉ大学医学院实验动物中心提供，清洁级【许可证号：ＳＹＸＫ（苏）２００８４３０３５１。２实验方法２．１Ｉｂｕ含量测定方法的建立２．１．１血浆预处理大鼠股动脉取血于肝素化的离心管中。３５００ｒ·Ⅱｌｉｎ－ｌ离心１０ｍｉｎ后取上清，于－７０℃冰箱中保存。２．１．２血样处理方法【蚓精密移取２００ｔｔＬ大鼠血浆样品，置于１．５ｍＬ离心管中，加入５０ｐＬ的甘草次酸内标液（４９嵋·ｍＬ－Ｉ），再加入７５０ｇＬ甲醇沉淀蛋白，涡旋，１００００ｒ·血ｎ－ｌ离心１０ｍｉｎ。取上清液８５０ｇＬ，４０℃水浴氮气挥干，１００ｔｉＬ甲醇复溶，１００００ｒ·ＩＩｌｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，进样２０止。２．１．３色谱条件色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ５ＣＩｓ－ＡＲ－ＩＩ（５ｔｔｍ，４．６ｘ１５０ｎｌｍ，美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相：甲醇一１．５％醋酸水（７７：２３）；检测波长：２２５ｎｍ；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ－＇；布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究柱温：３５℃：进样量：２０“Ｌ。２．１．４色谱行为按照“血样处理方法”项处理各样品，进样后约在５．０２ｍｉｎ和１５．６５ｍｉｎ出现两个色谱峰，其中，５．０２ｍｉｎ的色谱峰为布洛芬药物峰，１５．６５ｍｉｎ的色谱峰为内标峰，血浆中物质不干扰药物和内标物的测定，内标与血样中布洛芬达到基线分离。样品色谱图见图４－１。盈翮：酽。§ｊＬ．蓬＇｜船｜／一图４－１体内Ｉ－ＩＰＬＣ分析方法专属性考察①空白血浆蛳＋内标样品③Ｉｂｕ＋ＩＰＣ＋Ｐｈ标样品④含药血浆样品２．１．５血浆中Ｉｂｕ标准曲线的绘制取空白血浆２００ｌａＬ，加入内标５０ｐＬ，加入ｌｂｕ系列标准溶液２０“Ｌ和甲醇７３０ｌａＬ，配制成相当于Ｉｂｕ质量浓度分别为０．８１、１．６２、１６．２２、４０．５５、８１．０９、１６２．１８、４８６．５４ｌａｇ·ｍＬ－１的样品。按照“２．１．２”项下方法操作，建立标准曲线。以血浆中待测物质的浓度（Ｘ）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比（Ｙ）为纵坐标，标准曲线为Ｙ＝０．０５１２Ｘ＋０．０３１６，ｒ＝０．９９９５。结果表明ｌｂｕ在０．８１０９－～４８６．５４ｌａｇ·ｍＬｑ质量浓度范围内线性关系良好。。２．１．６提取回收率配制低，中，高三个浓度的ｌｂｕ甲醇溶液，在离心管中加２９第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价入２００Ｉ．ｔＬ大鼠血浆样品，加入５０ｐＬ内标和２０９ＬＩｂｕ甲醇溶液，再加入７３０ｋｔＬ甲醇沉淀蛋白，涡旋混合，１００００ｒ．ｍｉｎ。１离心１０ｍｉｎ。取上清液８５０ｌｘＬ，４０℃水浴氮气挥干，１００ｌａＬ甲醇复溶，取上清液２０ｐＬ注入ＨＰＬＣ色谱仪，记录，分析结果。与相同浓度的Ｉｂｕ甲醇溶液进行比较。平均提取回收率为（８５．４０４－２．７４）％。２．１．７方法回收率按提取回收率试验方法制备相关浓度的提取样品，进样测定，考察标准曲线的方法回收率。低、中、高三种浓度不同血浆样品的平均回收率在９９．１５－－－＇９７．９５％之间，方法准确度较高，满足生物样品测定要求。２．１．８精密度考察分别测定血浆Ｉｂｕ浓度分别为Ｏ．６４，６．４，６４１．ｔｇ·ｍＬ－ｌ的样品，考察日内精密度及日间精密度（５ｄ），结果显示３个浓度的日内和日间精密度的ＲＳＤ分别为４．２７％。５．６７％和４．７％。７．１％，符合体内样品标准，表明本实验精密度良好。２．２样品的制备精密称取１００ｍｇＩｂｕ，加入１０ｍＬｐＨ７．４的缓冲溶液，超声溶解，得浓度为１０ｎａｇ·ｍＬ－１的Ｉｂｕ注射液。按照处方工艺分别制备ＩＰＣ和Ｉｂｕ亚微乳，ＨＰＬＣ测定其含量，Ｉｂｕ亚微乳中Ｉｂｕ的含量为８．２３ｍｇ·ｉｌｌＬ－１，ＩＰＣ亚微乳中ＩＰＣ的含量为９．２３ｍｇ·ｍＬ－１。２．３给药及取样方法取大鼠１８只（２４０４－２０ｇ，雄性），随机分成３组，每组６只，第一组大鼠按１１．７ｍｇ·ｋｇ。１的剂量股静脉插管注射Ｉｂｕ溶液，第－－ｇｔ大鼠按相同剂量注射ｌｂｕ亚微乳，第三组大鼠注射相同摩尔量的ＩＰＣ亚微乳，为２０ｍｇ·ｋｇ‘１。给药后各组分别在１、３、５、１０、３０、６０、１２０、２４０、４８０、７２０ｍｉｎ股动脉取血约Ｏ．５ｍＬ，置于１％肝素润洗过的１．５ｍＬ塑料离心管中，于３５００ｒ·ｍｉｎ以离心ｌＯｍｉｎ取上清于＿７０℃冰箱中保存，待测【５５１。３结果与讨论３．１血药浓度测定结果大鼠股静脉注射ｌｂｕ溶液，ｌｂｕ亚微乳和ＩＰＣ亚微乳后取出各时间点样品，按“２．１．２”项下方法处理后分别进样，测定Ｉｂｕ在大鼠体内的浓度。具体结果见表４．１。并且绘制药物在血液中的浓度曲线见下图４－２。布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究表４—１大鼠静脉注射Ｐｃ亚微乳，Ｉｂｕ亚－微乳，ｌｂｕ溶液后Ｉｂｕ的血药浓度（ｘ：ｔ：ｓ，ｎｆｆｉ６）奄夸趟蠖榴鲁姗枷姗善瑚啪卯。Ｏ∞０４００６∞时间（ｍｔｎ）图４－２注射ＩＰＣ亚微乳，Ｉｂｕ溶液，Ｉｂｕ亚微乳后Ｉｂｕ的血药经时曲线（ｘ：Ｌ－ｓ，ｎ－－６）（◆）Ｉｂｕ溶液；（ｏ）Ｉｂｕ亚微乳；（▲）ＩＰＣ亚微乳３．２药物动力学参数计算３．２．１隔室模型拟合的药物动力学参数采用中国药理学会数学药理专业委员会编制的３Ｐ９７软件对Ｉｂｕ溶液，Ｉｂｕ亚微乳和ＩＰＣ亚微乳的血药浓度耐间曲线进行单隔室、双隔室模型、三隔室模型拟合，根据ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ’Ｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）和Ｒ２值判定药物制剂体内的药动模型，结果表明，Ｉｂｕ溶液，ｌｂｕ亚微乳和ＩＰＣ亚微乳均符合权重为１／Ｃ／Ｃ的二室模型，并计算相关药物动力学参数，结果见表４－２和表４－３。第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价．；Ｌ４－３股静脉注射Ｉｂｕ溶液，Ｉｂｕ亚微乳和Ｐｃ亚微乳的药动学参数（ｘ：：ｋｓ，ｎ＝６）３．２．２统计矩计算的药物动力学参数采用统计矩的原理对体内药时曲线进行非模型化解析，不受数学利用模型的，适用于任何隔室。利用３Ｐ９７药物动力学程序，对受试制剂和参比制剂进行统计矩计算。ＡＵＣ、ＡＵＭＣ、ＭＲＴ（平均滞留时间）等药动学参数如表４４所示，其中ＡＵＣ为血药浓度耐间曲线下从零到无穷大面积；ＡＵＭＣ为时间与血药浓度的乘积埘间曲线下从零到无穷大面积。表４＿４Ｉｂｕ统计矩计算的药物动力学参数３２布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第四章布洛芬一丹皮酚偶合物的药动学研究３．２．３相对生物利用度生物利用度是指服药后，药物吸收达到体循环的相对数量与相对速率，分为绝对生物利用度和相对生物利用度。相对生物利用度是不同剂型之间或同种剂型不同制剂之间的比较，可以下式计算。相对生物利用度：Ｆｒ（％）＝ＡＵＣｔＴ）／ＡＵＣｔＲ）Ｔ－供试品，Ｒ－对照品非隔室模型计算缓释制剂的生物利用度：首先，将Ｉｂｕ亚微乳和Ｉｂｕ溶液进行比较，Ｉｂｕ溶液作为对照品，Ｆ＝１０８．６４％；其次，将ＩＰＣ亚微乳和Ｉｂｕ亚微乳进行比较，Ｆ＝６１．３８％４本章小结本文建立了同时测定大鼠血浆中Ｉｂｕ和ＩＰＣ的ＨＰＬＣ分析方法。由于ＩＰＣ在血浆中很快降解为Ｉｂｕ，所以只测定了Ｉｂｕ的含量。根据３Ｐ９７软件拟合，所得药时曲线用隔室模型解析体内配置过程符合权重为１／Ｃ／Ｃ的二室模型吸收。采用非隔室模型解析可得分别为Ｉｂｕ溶液，Ｉｂｕ亚微乳及ＩＰＣ亚微乳的ＡＵＣ分别为１８１．８１、１９７．４５、１２１．１９（ｍｇ·ｍＬ以）·ｒａｉｎ＂１。与Ｉｂｕ溶液相比，Ｉｂｕ亚微乳在体内的初始浓度升高，半衰期延长，这说明将药物制备成亚微乳后，相对生物利用度提高；与ｌｂｕ亚微乳相比，ＩＰＣ亚微乳在体内的初始浓度降低，半衰期有一定延长，但是相对生物利用降低，这与ＩＰＣ在体内的经时过程发生改变有关，一方面ＩＰＣ降解成Ｉｂｕ需要时间，从而导致Ｉｂｕ初始浓度下降，另一方面，亚微乳能延长其在血液中循环的时间。‘３３第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究布洛芬（Ｉｂｕ）是苯丙酸类非甾体抗炎药物，由于抑制前列腺素的合成及游离羧基直接与胃肠道接触，长期反复使用时具有一定的胃肠道刺激性。ＩＰＣ是将Ｉｂｕ与丹皮酚偶合制得的酯类前体化合物，以期降低Ｉｂｕ的不良反应，并在体内水解成原形药物，达到协同治疗的目的。本文以小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法对ＩＰＣ和ｌｂｕ的抗炎镇痛作用进行了比较研究，并通过小鼠胃肠道刺激实验，考察了对胃肠道毒副作用的影响。１仪器、试剂及动物１．１仪器８ｉｎｍ打孔器，苏州大学药学院药理教研室提供：高速电动匀浆机（ＦＳＨ—ＩＩ），江苏金坛市环宇科学仪器厂；光学显微镜，日本奥林巴斯公司；紫外可见分光光度计（ＵＶ－２４０１），日本岛津公司。１．２试剂二甲苯（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；丙二醛（ＭＤＡ）￥Ｕ试盒（批号：２００９１２０１），南京建成生物工程研究所；Ｇｒｉｅｓｓ试剂的配制：０．１％奈Ｚ，－－胺溶液与１％磺胺（５％）磷酸溶液，于临用前１２ｈ内等体积混合备用。其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。１．３实验动物健康ｌ（Ｍ小鼠１３０只，雌雄各半，体重（２０土２）ｇ，购于苏州大学实验动物中心（许可证号：ＳＹＸＫ（苏）２００９旬１５９），所有动物购回后在苏州大学动物房饲养ｌ周，用混合配方饲料（苏州大学实验动物中心提供）喂养，自由进食饮水，每日更换饮水、饮料，保持小鼠生活环境通风及清洁卫生。确认小鼠健康及适应环境后，开始按照体重随机分组。２实验方法２．１ＩＰＣ对二甲苯致小鼠耳肿胀的实验方’法【５６】取昆明小鼠５０只，雌雄各半，体重（２０４－２）ｇ，随机分成５组：空白亚微乳组，Ｉｂｕ亚微乳组（１１５ｍｇ·Ｋｇ。１），ＩＰＣ亚微乳低（２ｃＨ０３４ｍｇ·Ｋｇ．１，与Ｉｂｕ组等摩尔量）、中、布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究高剂量组。小鼠禁食１２ｈ后灌胃给药，ｌｈ后将小鼠右耳廓两侧用移液吸取二甲苯６０止均匀涂布，左耳廓作为对照。致炎１ｈ后将小鼠脱颈椎致死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径８ｍｍ的打孔器在两耳廓同一位置各取一耳片，于电子天平上称重，计算肿胀度和抑制率。肿胀度；右耳重－左耳重抑制率；（空白组肿胀度均值＿用药组肿胀度均值）／空白对照组肿胀度均值）×１００％。２．２ＩＰＣ对醋酸所致小鼠扭体反应的实验方，法ｔ５６ｊ取昆明小鼠５０只，雌雄各半，体重（２０４－２）ｇ，随机分成５组：空白亚微乳组，Ｉｂｕ亚微乳组（１１５ｍｇ·Ｋｇｄ），ＩＰＣ亚微乳低（２００ｎａｇ·Ｋｇｄ，与Ｉｂｕ组等摩尔量）、中、高剂量组。小鼠禁食１２小时，灌胃给药（ｏ．０２ｍＬ·ｇ。１）后３ｈ，每只小鼠腹腔注射１．Ｏ％醋酸（０．０１ｍＬ·ｇ‘１），测定小鼠１５ｒａｉｎ内出现扭体次数（以小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起为扭体反应），计算镇痛率，比较组间差异显著性。镇痛率＝（空白组扭体次数始药组扭体次数）／空白组扭体次数ｘ１００％。２．３ＩＰＣ对小鼠胃肠道刺激性研究［５７，５８】２．３．１分组与给药取昆明小鼠３０只，雌雄各半，体重（２０４－２）ｇ，随机分成５组：空白亚微乳组，Ｉｂｕ亚微乳组（１１５ｍｇ·Ｋｇ－１），ＩＰＣ亚微乳低（２００ｍｇ·Ｋｇ。１，与Ｉｂｕ组等摩尔量）、中、高剂量组。小鼠连续灌胃给药４天，最后１天禁食２４ｈ，末次给药后１ｈ后摘眼球取血，处死，剖腹取胃。２．３．２小鼠胃粘膜损伤指数测定根据光镜下组织病理学改变计算胃粘膜损伤指数（１ｅｓｉｏｎｉｎｄｅｘ，ＬＩ）。评分标准：Ｏ，没有或者在５个以下点状损伤；ｌ，大于５个点状损伤；２，１到５个小溃疡；３，大于５个小溃疡或是一个大溃疡；４，大于一个大溃疡。２．３．３小鼠胃粘膜损伤病理切片观察将小鼠胃浸泡在１０％溶液中。从每组中选取有代表性的样品做病理切片（ＨＥ染色），用显微镜观察，并拍摄病理切片的显微照片。２．３．４小鼠胃组织中ＰＧＥ２含量测定将小鼠胃沿胃大弯剪开，用４＊０生理盐水冲净，滤纸吸干称重，剪碎浸泡于１ｍＬ生理盐水中，用高速机械匀浆机制备胃组织混合物，将其以３０００ｒ·ｍｉｎｄ离心２０ｍｉｎ，取上清液得Ｎ４，鼠胃组织匀浆。取小鼠胃组织匀浆Ｏ．２ｍＬ，依次加无水乙醇０．６ｍＬ，０．５ＮＫＯＨ－ＣＨ３０Ｈ１ｍＬ３５第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价溶液混匀，５０℃水浴异构化２０ｍｉｎ，冷却后加入甲醇至４ｍＬ，３０００ｒ·ｒａｉｎ以离心１０ｍｉｎ，于分光光度计２７８的含量。ＰＧＥ２（ｎｍ０１）＝Ａｘｌ３．１３ｘＤｘＶｘｌ０３／Ｍｍ处测吸光度Ａ值，按下列公式计算小鼠胃组织中ＰＧＥ２Ａ：吸光度Ｄ：稀释倍数（２０）Ｖ：体积（１ｍＬ）Ｍ：ＰＥＧ分子量（３５２）２．３．５小鼠胃组织中ＭＤＡ含量测定取小鼠胃组织匀浆０．３ｍＬ，使用ＭＤＡ试剂盒测定胃组织中ＭＤＡ含量。２．３．６小鼠胃组织中ＮＯ含量测定取小鼠胃组织匀浆０．５ｍＬ，加入Ｇｒｉｅｓｓ试剂２ｍＬ中，混匀后静置２０ｍｉｎ后，于５５０ｎｎｌ处测吸光度Ａ值。按ＮＯ标准曲线计算胃组织中ＮＯ的含量。２．４ＩＰＣ在体外对ＤＰＰＨ自由基的清除作用【５９】精密配制０．０５ｎ＇ｕ＇ｎｏｌ·Ｌ。１的ＤＰＰＨ（现配现用）以及８．０ｍｇ·ｍＬ一的样品的无水乙醇（分析纯）溶液。取０．０３１２５，０．０６２５，０．１２５，Ｏ．２５，Ｏ．５，１．０，２．０ｍＬ样品溶液，分别与３ｍＬＤＰＰＨ溶液混合，并加入无水乙醇定容至５ｍＬ。立即振摇混合液，室温下避光放置３０ｍｉｎ。测定其在５１７ｎｎｌ处吸光度降低的值。ｖＥ作为阳性对照，未加入ＤＰＰＨ的样品溶液作为样品空白。清除作用用ＤＰＰＨ自由基在５１７ｎｎｌ处吸光度的降低值测定，使用以下方程进行计算：清除率（％）＝［Ａｂ一（Ａｓ－Ａｓｂ）］／Ａｂ＊１００Ａｂ，Ａｓ和Ａｓｂ分别为空白ＤＰＰＨ溶液、样品及对照品ＤＰＰＨ溶液、以及空白样品溶液在５１７１１１１１处的吸光度。．２．５统计学方法统计数据以ｚ蚵表示，数据分析采用ＳＰＳＳｌ７．０软件，组间差异比较采用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），当尸＜０．０５时判定具有显著性差异，组间差异的比较采用ｒ检验。３结果与讨论３．１ＩＰＣ对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响由表５．１所示，与空白组比较，Ｉｂｕ组及ＩＰＣ低、中、高剂量组均能抑制二甲苯所致小鼠的耳片肿胀；与Ｉｂｕ组比较，ＩＰＣ低、中、高剂量组均能抑制二甲苯所致小鼠的耳片肿胀，其中ＩＰＣ中和高剂量组能够显著抑制肿胀（Ｐ＜０．０５）；剂量越大，ＩＰＣ对二甲苯所致小鼠的耳片肿胀的抑制率越高。布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究表５－１ＩＰＣ对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（；衄，ｎ＝ｌＯ）ａ与Ｉｂｕ组比较有显著性差异，Ｐ＜０．０５·相同摩尔量３．２ＩＰＣ对醋酸所致小鼠扭体反应的影响由表５．２可见，与空白组比较，Ｉｂｕ组及ＩＰＣ亚微乳低、中、高剂量组均能明显抑制醋酸所致小鼠腹部疼痛，减少扭体反应的发生：与ｌｂｕ组相比，ＩＰＣ各剂量组对抑制醋酸所致小鼠扭体反应没有显著性差异伊＞０．０５）；ＩＰＣ三个剂量组的对小鼠扭体反应的抑制作用随剂量的增高而增强，具有显著性差异护＜Ｏ．０５）．表５－２ＩＰＣ对醋酸所致小鼠扭体反应影响（；衄，ｎ＝ｌＯ）·相同摩尔量３．３Ｉ＿ＰＣ对小鼠胃肠道刺激性的实验结果３．３．１ＩＰＣ对小鼠体重和胃重的影响如表５．３所示，与空白组比较，ＩＰＣ亚微乳低、中、高三个剂量组连续给药４天后，对小鼠胃壁和胃粘膜未见明显可见不良反应，对小鼠体重及胃重均无明显影响俨＞０．０５）；而Ｉｂｕ连续给药４天后，可能由于胃壁变薄及胃粘膜溃疡的发生率较高，小鼠体重及胃重均有下降趋势，但与空白组相比，无显著性差异俨＞０．０５）。第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价空白２２．４４－４－１．９６ｌ８８．２８士２２．８５Ｉｂｕ亚微乳１１５幸２０．４４＋２．Ｏ１ｌ７８．６３－４－１０．６９ＩＰＣ亚微乳ｌＯＯ２２．５６－ａ：１．６８ｌ８８．７８士２５．６ｌ２００＊２２．３８－４－３．６７１９２．５２－４－２８．６８４００２１．０７土１．６９１７６．９４士２５．７４·相同摩尔量３．３．２小鼠胃粘膜损伤肉眼观察小鼠处死后取胃，向胃内注射１０％溶液２ｍＬ，将胃浸入１０％溶液中浸泡１０ｒａｉｎ，沿胃大弯剪开胃，洗净胃内容物。肉眼观察各组均未见明显溃疡和出血点，故无法进行损伤指数的测定。３．３．３小鼠胃粘膜损伤病理切片观察由图５．１可见，空白组的胃上皮细胞及腺细胞形态和分布正常，黏膜层完整，腺细胞排列均匀，黏膜下层、肌层、浆膜层完好，部分标本有缺损；Ｉｂｕ组的胃粘膜有部分缺损现象，腺体部分被破坏，粘膜下层、浆膜层见大量炎性细胞浸润；ＩＰＣ低、中、高三个剂量组的胃黏膜较完整，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，未见炎症细胞浸润及溃疡，与空白组较接近。震攀一一一黧ｉ醴藏雾灞一布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究图５．１给药后各组胃的组织病理学变４９（ＨＥ染色，×１０）①空白对照组②Ｉｂｕ亚微乳③ＩＰＣ低剂量组④ＩＰＣ中剂量组⑤ＩＰＣ高剂量组３．３．４小鼠胃组织ＰＧＥ２、ＮＯ及ＭＤＡ含量测定结果由表５＿４可见，与空白组比较，Ｉｂｕ及ＩＰＣ高剂量组的ＰＧＥ２含量无显著性变化妒＞０．０５）；ＩＰＣ低剂量组和中剂量组中ＰＧＥ２含量显著性增高（尸＜０．０５）；与Ｉｂｕ组比较，ＩＰＣ低剂量组和中剂量组中ＰＧＥ２含量显著性增高（尸＜０．０５）。与空白组比较，ｌｂｕ中ＮＯ的含量显著性降低（尸＜０．０５），ＩＰＣ低、中、高剂量组均无显著性差异伊＞０．０５）。Ｉｂｕ组、ＩＰＣ中剂量组及高剂量组中ＭＤＡ的含量与空白组比较，无显著性差异（Ｐ＞ｏ．０５）；与空白组及Ｉｂｕ组比较，ＩＰＣ中剂量组中ＭＤＡ的含量显著性降低伊＜０．０５）。表５．４ＩＰＣ对小鼠胃组织中ＰＧＥ２、ＮＯ及ＭＤＡ含量的影响（ｘ旬，ｎ＿６）ａ与空白组比较有显著性差异，Ｐ＜０．０５ｂ与Ｉｂｕ组比较有显著性差异，Ｐ＜Ｏ．０５·相同摩尔量３．４ＩＰＣ对ＤＰＰＨ的清除作用结果结果见图５．２。在图中，ＩＰＣ对ＤＰＰＨ均有清除作用，但是都远远低于阳性对照的ＶＥ对ＤＰＰＨ的清除率。ＩＰＣ浓度为４ｍｇ·ｍＬ‘１时，清除率为６．３３％，浓度为８ｍｇ·ｍＬ＂１清除率为６．９３％，清除率基本稳定，不再上升。第五章布洛芬一丹皮酚偶合物的药理学研究布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价∞∞俺∞卯∞∞ＯＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｍ１）图５－２［ＰＣ对ＤＰＰＨ的清除率（工妇，ｎ＝６）（－）ＩＰＣ；（ｏ）Ｉｂｕ；（Ａ）Ｐａｅ；（◆）ＶＥ４本章小结二甲苯致小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法实验表明，在相同剂量下，与Ｉｂｕ相比，［ＰＣ具有较好的抗炎镇痛作用。镜下病理切片观察可知，ＩＰＣ低、中、高三个剂量组的胃黏膜较完整，与空白组接近，说明与Ｉｂｕ相比，其对小鼠胃肠道刺激性显著降低。与Ｉｂｕ组比较，在相同剂量下，ＩＰＣ组中小鼠胃组织的ＰＧＥａ含量降低，从而说明胃组织中ＰＧ合成减少与ＮＳＡＩＤｓ引起的胃粘膜损伤有密切关系。ＮＯ既可直接形成ＮＯ自由基，产生细胞毒作用，也可在酸性条件下继发生成具有高度活性的羟自由基，导致胃粘膜受损；Ｉｂｕ可致小鼠胃组织ＮＯ含量异常降低，而ＩＰＣ不同剂量组均呈现ＮＯ含量升高，可见胃组织ＮＯ的含量与胃粘膜损伤不一定存在关系。氧自由基（ＯＦＲ）既参与组织细胞的损伤过程，也是细胞正常代谢的中间产物，在环氧酶催化下由花生四烯酸（ＡＡ）生成ＰＯｓ过程中伴有ＯＦＲ产生。ＭＤＡ为ＯＦＲ的脂质过氧化产物。通过抑制ＰＧ合成酶使ＡＡ代谢过程受阻，ＰＧ合成减少，故也可能导致ＭＤＡ生成减少。ＩＰＣ高、中剂量组均可使小鼠胃组织中ＭＤＡ含量降低。研究表明，ＰＣ的抗炎镇痛效果优于相同摩尔质量的Ｉｂｕ，而其胃肠道刺激性小于Ｉｂｕ，这可能因为成酯后避免了Ｉｂｕ对胃肠道的直接刺激，另一方面可能是ＩＰＣ进入血液后分解产生的Ｐａｅ对胃肠道具有抗氧化作用，也可能是因为实验中给药剂量不足，给药时间过短造成的。４０布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价全文总结全文总结１．建立了ＩＰＣ的体外ＨＰＬＣ分析方法。研究了ＩＰＣ的理化性质，包括溶解度、油水分配系数。接着研究了ＩＰＣ在高温、高湿、光照条件下的初步稳定性，然后考察了ＩＰＣ在不同ｐＨ值缓冲溶液及血浆中的稳定。通过研究发现ＩＰＣ在水中溶解度很低，属于水难溶性药物，为下面剂型的选择提供了理论依据。２．由于ＩＰＣ的难溶性，根据经典静脉注射脂肪乳处方将其制备成粗乳，采用高压均质法得到亚微乳，以药物含量和平均粒径为评价指标。制备得到的亚微乳粒径为１８２４－２ｎｌｌ＇ｌ，分布均匀，含量为９．２３ｍｇ·ｍＬ＂１。３．建立了大鼠肠吸收样品的ＨＰＬＣ分析方法。采用大鼠在体单向灌流技术，应用质量法测定。实验结果表明药物在各肠段均有良好的吸收，其中，空肠的吸收速率最高。不同浓度的ＩＰＣ在大鼠十二指肠中吸收情况存在显著性差异，浓度越高，吸收速率越低。４．建立了血浆中同时测定Ｉｂｕ与ＩＰＣ的ＨＰＬＣ分析方法。采用大鼠股动脉插管法，考察了大鼠股静脉注射［ＰＣ亚微乳的药物动力学性质。以Ｉｂｕ溶液和Ｉｂｕ亚微乳为对照，ＩＰＣ亚微乳在体内的初始浓度降低，半衰期延长，但是相对生物利用降低。５．以Ｉｂｕ为对照组，采用二甲苯致小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法考察了了ＩＰＣ的抗炎镇痛活性。其次，为了考察ＩＰＣ对小鼠胃肠道的刺激性，测定了小鼠胃组织中的ＭＤＡ、ＰＧＥ２及ＮＯ含量，并于Ｉｂｕ进行了比较。最后考察了ＩＰＣ的体外抗氧化活性。４１参考文献布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价参考文献【１】１１０．１１２．沈博，李晓光．非甾体抗炎药的进展［Ｊ】．吉林医药学院学报，２００９，３０（２）：【２】２３３．２３４．苏怀德．我国第一个非处方药．布洛芬【Ｊ】．中国医药导刊，２００１，３（３）：【３】Ｍ．Ｓ．ＹＫｈａｎ，ＭｙｍｏｏｎａｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｂｅｈａｖｉｏｒＡｋｈｔｅｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｏｆｏｆｇｌｙｃｅｒｉｄｅｐｒｏｄｒｕｇｓｉｂｕｐｒｏｆｅｎ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４０：３７１—３７６．【４】ＢａｒｂａｒａＺａｗｉｄｌａｋ－Ｗｅｇｒｚｙｎｓｋａ，ＭｉｃｈａｌａｎｄＫａｗａｌｅｃ，ＩｚａｂｅｌａＢｏｓｅｋ．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｆｌＰＣｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎ－ｏｌｉｇｏ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ［Ｊ】．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４５：１８３３·１８４２．【５】马涛，曹颖林，郑雪娜．布洛芬川芎嗪酯的抗炎镇痛作用叨．沈阳药科大学学报，２００４，２１（１）：６２．６４．【６】王建刚，钟芳丽，王凤成．布洛芬愈创木酚酯及有关物质的ＨＰＬＣ测定［Ｊ】．中国医药工业杂志，２００４，３５（１２）：７４４．７４６．【７】赵秀丽，陈大为，李可欣．布洛芬丁香酚酯前体药物的合成及其水解动力学［Ｊ】．沈阳药科大学学报，２００６，２３（２）：７０－７３．【８】赵一玫，夏丹，艾彩萍，等．布洛芬衍生物的合成及抗炎活性【Ｊ】．中国药物化学杂志，２００５，１５（６）：３６０．３６２．【９】ＲａｉｎｅｒＫ．Ｕｈｒｉｇ，ＭａｒｔｉｎａｎｄＡ．Ｐｉｃａｒｄ，ＫｏｎｒａｄＢｅｙｒ．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２０００，３２５：ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓｇｌｕｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ７２．８０．【１０】ＨｅｎｋＳｗａｒｔ，ＪａｃｏＣ．Ｂｒｅｙｔｅｎｂａｃｈ，ＪｏｎａｔｈａｎｇｌｙｃｏｓｉｄｅＨａｄｇｒａｆｉ．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＪｏｕｒｎａｌｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＳＡＩＤｅｓｔｅｒｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００５，３０１：７１—７９．【１１】ＸｉａｎｇｇｕｏＺｈａｏ，ＸｉｎｙｉＴａｏ，Ｄｏｎｇｚ乙ｌｌｉＷｅｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｎｏｖｅｌ．ｉｂｕｐｒｏｆｅｎｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ［Ｊ】．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４１：１３５２．１３５８．４２布洛芬一丹皮酚偶合物的体内外评价参考文献【１２】宋妮，李英霞，孙雪，等．布洛芬糖衍生物的合成［Ｊ】．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