拟南芥AtDWD与DDB1相互作用研究

吴叶天;李德款;杨毅

【摘 要】In our study,the yeasttwo-hybrid assay (Y2H) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) have been applied to investigate the interaction between AtDWD and DDB1a/DDB1b (the CUL4-based E3 ligase interacts with the substrate receptor to target special substrates)in vitro and in vivo.It has shown strong interaction between AtDWD and

DDB1b,but weak interaction between AtDWD and DDB1a.Moreover,the C-terminal of AtDWD was where the interaction happened.The results suggested that AtDWDmight be a substrate receptor protein of CUL4-based E3 ligase.On the other hand,the AtDWD-overexpression transgenic plants'were sensitive to freeze.AtDWD may play a role in plant reacting in freezing stress.%本文通过酵母双杂交实验(Y2H)和双荧光互补实验(BIFC)分别从体外和体内条件下检测了AtDWD与CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白结合蛋白DDB1a和DDB1b的相互作用,发现AtDWD与DDB1b有较强的相互作用,而与DDB1a的相互作用较弱,相互作用区域位于AtDWD的C末端部位.说明了AtDWD是潜在的CUL4型E3连接酶的底物识别亚基.此外,本文中还发现AtDWD过表达植株对冷冻胁迫更加敏感.AtDWD可能参与冷胁迫信号通路. 【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2017(0)002 【总页数】6页(P411-416)

【关键词】DDB1;AtDWD;E3连接酶;植物冷冻胁迫 【作 者】吴叶天;李德款;杨毅

【作者单位】四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都6100;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都6100;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都6100

【正文语种】中 文 【中图分类】Q78

泛素化—蛋白酶体途径是包括植物在内的真核生物细胞内蛋白质稳定性的一条主要通路.蛋白质被泛素化的过程需要泛素激活酶(E1)，泛素结合酶(E2)，以及泛素连接酶(E3)的参与，而其中泛素连接酶(E3)直接结合底物，E3对底物的特异性识别决定了整条通路特异性[1,2].

E3泛素连接酶有很多不同的种类.有的由单个蛋白质构成，被称为单亚基E3；有的由多个蛋白质组成的复合体构成，被称为多亚基E3.多亚基E3中有一类以cullin支架蛋白为基础构成，在植物中这类E3有4种，分别被称为CUL1型/SCF型E3、CUL2型/APC型E3、CUL3型/BCR型E3和CUL4型/DCX型E3[3,4,5]. CUL4型E3由RBX1/ROC1、CUL4、DDB1以及底物识别蛋白质构成，RBX1起着募集E2泛素结合酶的作用，CUL4连接着RBX1和DDB1，底物识别蛋白特异性结合底物蛋白, DDB1在CUL4型E3连接酶中起着CUL4和底物识别蛋白质之间的桥梁作用[6,7].在拟南芥中DDB1不单单指一个特定蛋白质，而由DDB1a和DDB1b这2个高度同源的蛋白质在起作用[8,9].已经有过报道的CUL4型E3连接酶底物识别蛋白中很大一部分有着一个共同点——含有DWD基序，而AtDWD

中含有DWD基序，之前有文献报道在酵母双杂交实验中AtDWD和DDB1a间有相互作用[10].

在其它文献中AtDWD被作为核孔蛋白质复合体的一员被研究，发现HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 1 (HOS1)是与AtDWD免疫共沉淀的蛋白质之一[11].而HOS1则是植物冷应激的重要基因,本文因此进一步检测了AtDWD与DDB1a/DDB1b的相互作用.此外,检测了相关植株的耐冻情况.

植物材料：野生型Col、AtDWD过表达植株、Atdwd突变体(杂合子)和本生烟(N. benthamiana)，均为本实验室保存.

菌株：大肠杆菌DH5α菌株、酵母AH109菌株和农杆菌 GV3101菌株，均为本实验室保存.

载体：酵母双杂交实验使用诱饵蛋白质表达载体pGBKT7(BD)，筛选蛋白质表达载体pGADT7(AD)，由本实验室保存.烟草双荧光实验所用载体改造自

pEarleyGate201-YC 和 pEarleyGate202-YN，简称为CE与NE，由本实验室保存.

试剂：构建载体所需性内切酶和T4 Ligation Kit购自Fermentas，酵母双杂交所需试剂购自Clontech，乙酰丁香酮(AS)购自Sigma，Trizol试剂盒购自Takara,反转录试剂盒购自TOYOBO,其余常用试剂为实验室现存.

设计引物(表1,表2)从拟南芥cDNA中通过PCR获取目的基因AtDWD、DDB1a、DDB1b.PCR扩增操作如下：向20μL离心管管内加入4μL 5×PS Buffer，1.6μL dNTPs(2.5mM each),1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL拟南芥cDNA,0.2μL PrimerStar DNA Polymerase(2.5U/μL)和11.2μL dd H2O混匀，转入PCR仪中，PCR过程为：95℃变性3min，然后按98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 片段长度×5s/kb 进行30个循环，72℃延伸10min.

PCR产物进行琼脂凝胶电泳，对目的片段切胶，使用胶回收试剂盒进行回收得到目的片段.

AtDWD在拟南芥基因组中编号为At1g 80670.与CUL4相互作用的蛋白质中有一类有着至少一个类似的氨基酸基序，被称为DWD基序[10].

利用MEGA3.1对AtDWD蛋白质氨基酸序列分析可知，其有2个DWD基序，分别位于128～144位氨基酸处和261～275位氨基酸处(图1).保守的氨基酸会被标上颜色，疏水氨基酸被涂上黄色背景，小氨基酸被涂上灰色背景.

为了检验体外条件下，DDB1a和DDB1b与AtDWD相互作用情况，我们进行了酵母双杂交实验.

同时转入AtDWD与DDB1a酵母双杂交载体的酵母菌在SD/-Trp-Leu-His缺乏3种氨基酸的培养基上可以生长(图2A)，但是不能在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺乏3种氨基酸和腺嘌呤的更严格的筛选培养基上生长，而转入AtDWD与DDB1b酵母双杂交载体的酵母菌即使在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺乏3种氨基酸和腺嘌呤的更严格的筛选培养基上也生长良好(图2B).说明AtDWD与DDB1b有较强的相互作用，而AtDWD与DDB1a的相互作用较弱.

为了检验体内条件下，DDB1a和DDB1b与AtDWD相互作用情况，我们进行了烟草双荧光实验.DDB1b与AtDWD的烟草双荧光载体转入烟草后烟草叶片中出现了明显的荧光，荧光勾勒出叶表皮细胞完整的轮廓，而细胞核中也发出明显的荧光，形成了一个明显的亮点.表明DDB1b和AtDWD在植物体内有相互作用，有相互作用的区域包括细胞核和细胞质(图2C).

DDB1a与AtDWD的烟草双荧光载体转入烟草后烟草叶片中出现了微弱的荧光，比起副对照荧光要强一些，不过还是非常弱，而且细胞核中没有显现出荧光(图2A).

烟草双荧光实验进一步说明了，体内条件下DDB1b与AtDWD具有相互作用，相

互作用的区域包括细胞核和细胞质中，而AtDWD与DDB1a在体内条件下相互作用弱.

3.3 酵母双杂交实验检测AtDWD分段与DDB1b相互作用

由对AtDWD序列分析所知道的DWD基序位置，AtDWD被分为1-145和145-350这2段，每段各包括一个DWD基序，酵母双杂交实验发现AtDWD1-145与DDB1b没有表现出相互作用而AtDWD145-350与DDB1b表现出相互作用(图3).之后AtDWD145-350被分为AtDWD145-229和AtDWD229-350两段，DWD基序在AtDWD229-350这段中，但是AtDWD145-229和AtDWD229-350这两段都没有表现出与DDB1b的相互作用(图3).

野生型拟南芥Col、Atdwd突变体(杂合子)以及两个AtDWD过表达株系被选用进行植物冷冻测试.测试结束2d后观察植物表型，大部分有绿色叶片的存活植株属于Col和Atdwd突变体(杂合子)；两个AtDWD过表达株系中大部分被冻死，植株失去绿色变得发白.(图4)

根据植株表型统计各株系存活率，可以认为AtDWD过表达株系表现出对冷冻胁迫敏感.

泛素化—蛋白酶体途径是包括植物在内的真核生物细胞内蛋白质稳定性的一条主要通路.本文探究了对拟南芥AtDWD基因表达的蛋白质作为CUL4型E3连接酶[4，5]中的底物结合蛋白质的潜力.

首先，本文研究了AtDWD与DDB1的相互作用.确定了AtDWD是CUL4型E3连接酶的一个亚基.

DDB1在E3泛素连接酶中起着CUL4和底物识别蛋白质之间的桥梁作用.在拟南芥中DDB1不单单指一个特定蛋白质，而分为DDB1a和DDB1b这2个高度同源的蛋白质在起作用，DDB1a和DDB1b功能上有着差异但是都可以参与构成E3泛素连接酶[8,9].为了可靠地检验AtDWD与DDB1的相互作用，本文中运用酵母双

杂交实验从体外条件和烟草双荧光实验从体内条件检验AtDWD与DDB1a的相互作用以及AtDWD与DDB1b的相互作用.之前有文献报道酵母双杂交实验中AtDWD与DDB1a显示出相互作用[8]，但是此文中使用的酵母双杂交系统与本实验室使用的有差别，而在本实验室的酵母双杂交实验中AtDWD与DDB1a在较低选择压下显示出相互作用(图2A),而在较高选择压下显示不出相互作用，但是AtDWD与DDB1b在较高选择压下显示出明显的相互作用(图2B).而BIFC实验结果也反映了这一点：共转AtDWD与DDB1b的烟草叶片显现出明显的荧光，而共转AtDWD与DDB1a的烟草叶片中的荧光相对而言非常不明显.实验结果表明，AtDWD与DDB1a有较弱的相互作用，而AtDWD与DDB1b有较强的相互作用.AtDWD与DDB1具有相互作用得到了验证.

上文中提到过已知DDB1a和DDB1b功能相互冗余但是也有差别.DDB1a和DDB1b功能差异也许与AtDWD有关.

在其他文献中AtDWD被作为核孔蛋白质复合体的一员被研究，发现HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 1 (HOS1)是与AtDWD免疫共沉淀的蛋白质之一[14].而HOS1则是植物冷应激的重要基因，植物受到冷胁迫的时候，C-Repeat Binding Factor (CBF)转录因子通过直接结合顺式作用元件C-repeat (CRT)/dehydration-responsive (DRE)来诱导下游诸多应对冷胁迫的基因表达.ICE1转录因子(inducer of cbf expression 1)则通过结合在CBF3基因的启动子上诱导CBF3表达.HOS1通过泛素途径诱导ICE1降解，起到了植物应对冷胁迫的负因子的作用.[11,15,16]不过hos1突变体在受冷冻胁迫的研究下，存活率要低于野生型拟南芥，尽管在低于零度摄氏度的条件下，CBF下游基因依然高度表达.[7]而本文也发现AtDWD过表达株系经历冷冻测试后存活率降低，HOS1在AtDWD过表达植株中被更多的降解可能是造成这种表型的原因. 未来要确证AtDWD是否为CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白，还有许多工作要

做.例如检测AtDWD突变体中相关基因的表达情况；构建CUL4型E3连接酶体外泛素化体系，检验其体外泛素化能力等等[17].