鱼类胰弹性蛋白酶的研究进展

维普资讯 http://www.cqvip.com 徐波　葛熹凯　何意忠　杨子荣　张建超　陈韬　１．湖南农业大学动物医学院，湖南，长沙４１０１２８；　２．湖南农业大学动物科技学院，湖南，　沙４１０１２８　摘要：本文综述了国内外鱼类胰弹性蛋白酶的分离纯化、特性研究和系统发育分析。阐明了鱼类胰弹性　蛋白酶结构与功能的关系，有助于了解鱼类的消化生理特点，为水产饲料的研究提供理论依据。　关键词：鱼类；丝氨酸蛋白酶；弹性蛋白酶；分离纯化；系统发育分析　胰液中含有三种肽链内切　酶，分别是胰蛋白酶、胰凝乳蛋　白酶和弹性蛋白酶。弹性蛋白酶　胰弹性蛋白酶的激活与失活都受　胰蛋白酶调节，弹性蛋白酶原在　胰腺中合成，并以非活性的酶原　的研究不多，而且国外要比国内　开展得早且深入。已有研究报道　了非洲肺鱼、鲤鱼、鲶鱼、鳕　鱼、金鱼、虹鳟鱼、角鲨、大　属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种　消化酶，在鱼类食物蛋白质的消　化过程中承担着重要的生理功　能。弹性蛋白酶以水解不溶性弹　性硬蛋白（Ｅｌａｓｔｉｎ）为特征，　专一性裂解丙氨酸、甘氨酸、丝　形式分泌到消化道中，在消化道　中酶原被胰蛋白酶从肽链Ｎ端断　开肽键，失去一段短肽，分子构　象发生一定改变后转变为有活性　的弹性蛋白酶。本文综述国内外　鱼类胰弹性蛋白酶分离纯化、特　西洋鲑胰弹性蛋白酶纯化和鉴定　工作。国内外鱼类胰弹性蛋白酶　分离纯化工作，主要集中在海水　鱼类，少有淡水鱼类。　胰弹性蛋白酶的分离纯化遵　氨酸等小的中性氨基酸残基羧基　侧链与其它氨基酸的氨基所形成　的肽键，具有较广泛的水解蛋白　活性。　性研究、氨基酸组成以及序列分　析等方面的研究工作，进一步阐　明鱼类消化生理机制，为水产饲　料的配制和研究提供科学的理论　依据。　循蛋白质分离纯化的一般原则。　总纯化程序可以分为三步：组织　样品前处理、粗分级分离和细分　级分离，主要是利用蛋白质之间　特异性的差异进行分离，如分子　的大小、形状、酸碱性、溶解　性、溶解度、极性、电荷和与其　弹性蛋白酶主要存在于动物　胰脏，在皮肤、主动脉、血小　板、白血球中也有存在。鱼类胰　弹性蛋白酶主要来源于肝胰脏、　肠道和幽门盲囊。结构上，弹性　１鱼　类陵弹性蛋白　酶的分离纯　化研究　０　ｌｌ。　科学家已经成功分离出了许　多哺乳动物的胰弹性蛋白酶，例　他分子的亲和性等。常用的分离　纯化方法和技术有：沉淀法（盐　蛋白酶原与胰凝乳蛋白酶原等胰　如猪、鼠及人类，并在此基础上　开展了大量研究工作。有关鱼类　胰腺丝氨酸蛋白消化酶的研究也　分级沉淀、有机溶剂沉淀等）、　离心、透析、层析法等等。粗分　级分离是用盐析和离心等简单的　分离方式获得粗品，后期细分及　丝氨酸蛋白酶相似，均具有一条　信号肽、一条激活肽和一条成熟　肽，功能蛋白通过信号肽形成。　有报道，但有关鱼类弹性蛋白酶　２６《北京水产》２００８第３期总第１１２期　维普资讯 http://www.cqvip.com 科普天地囊　分离获得纯品时偏向于用层析　鲨胰提取物中纯化鉴定了胰弹　耐受能力，如北大西洋鲑鱼在　法，其中较为经典的方法为凝　性蛋白酶的两种亚型，ＥＩ和　ｐｈ值为４．０～１１．０的条件下仍具　胶过滤层析法，离子交换层析　ＥＩＩ。两种酶在３７￣Ｃ均对弹性蛋　有较高的催化活性。大部分鱼　法和亲和层析法。通过凝胶过　白酶特异性高敏感底物琥珀酰　类弹性蛋白酶在ｐｈ值低于４．０的　滤层析可脱去盐等小分子杂　（丙氨酸）３对硝基苯胺（Ｓｕｃ—　酸性条件下变得不稳定，有个　质。离子交换层析一般是进行　ＡＡＡ—ｐＮＡ）表现出高度的催化活　别种在ｐｈ值低于７．０时稳定性降　阴离子交换，因为鱼类胰弹性　性，但却具有不同的催化参　低，如大西洋鲑鱼的最适ｐｈ值　蛋白酶在中性及碱性溶液中一　数。Ｂｅｒｇｌｕｎｄ　ＧＩ等（１９９８）从　在为８．０～９．５，当ｐｈ值＜４．０时　般以阴离子形式存在。亲和层　北大西洋鲑鱼的幽门盲囊纯化　酶活性明显降低，可见鱼类胰　析一般采用胰弹性蛋白酶抑制　鉴定了胰弹性蛋白酶，对该酶　弹性蛋白酶大都呈中性或弱碱　剂作为亲和配体，主要采用亲和　的生物学特性和动力学特性做　性。同属不同种的鱼类的酶适　层析，填料为　］ｈａ哟Ｓｅ－４Ｂ。如　了深入研究，同时与猪的胰弹　宜ｐｈ值有时也存在明显差异，　ｇｕｎｎａｒ　Ｉ．Ｂｅｒ１ｕｎｄ等从大西洋　性蛋白酶性质做了比较。　就是同一种鱼的酶活性在不同　鲑鱼幽门盲囊组织中纯化弹性蛋　Ｕ１ｉｔｉｎａ　ＮＮ等（２００５）首次从　的ｐｈ值条件下也会有所差异，　白酶的过程为：用Ｐ—Ａｍ　欧洲鲇鱼中分离纯化了三种丝　ｐｈ值是影响消化酶活性的关键　ｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一６Ｂ　氨酸蛋白消化酶，包括三种胰　因素之一。　层析柱去除粗提取液胰蛋白　蛋白酶的亚型，三种胰凝乳蛋　温度是影响酶促反应的重要　酶，超滤膜浓缩流出液后过　白酶的亚型和两种弹性蛋白酶　因素，温度的变化影响酶活　ｐｈｅｎＹ１一Ｓ　ｅＰｈａｒｏ　Ｓ　ｅ一６ＦＦ层　的亚型。８ａｋｈａｒｏｖ　ＩＩｕ等利用　力。鱼类生活环境的差异即所　析柱、过Ｑ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ离子交　离子交换层析法和凝胶过滤层　在环境温度的变化，对酶的活　换柱、过ＳＰ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ离子　析法从中国鲎的肝胰腺纯化出　力也相应地发生影响。一般而　交换柱、过铜离子螯合柱去除　对特异底物Ｂｏｃ－（Ａｌａ）３一　言，鱼类消化酶活力的最适温　胰凝乳蛋白酶、最后过　ｐＮＡ具有高度催化活性的弹性蛋　度均高于其所处的环境温度。　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５凝胶过滤层析柱，　白酶，这也是最早有关从甲壳　鱼类胰弹性蛋白酶的最适反应　完成最后一步精细纯化获得蛋　动物中分离纯化出弹性蛋白酶　温度在３０～６０℃范围内，这与　白酶纯品。　的研究报道。　大多数消化酶适宜的温度范围　鱼类胰弹性　每｜９Ｉ的特性研　２．１　ｐｈ值和温度对胰弹性蛋白　相一致，如鳕鱼弹性蛋白酶在　究≮ｌｌ；　ｊ　誓　０　酶的影响　４５℃反应温度下针对Ｓｕｃ—ＡＡＡ—　在国内，江信红等从黄鳝肠　据国内外学者的研究，鱼　ｐＮ表现出最高催化效率，但是　道分离纯化出三种具有弹性蛋　类胰弹性蛋白酶一般在ｐｈ值为　弹性蛋白酶稳定温度范围与其　白酶活性的同工酶。谢一荣等　５．０～９．０的条件下非常稳定。　最适反应温度是不同的，为了　研究了鱼类弹性蛋白酶等主要　ｐｈ值对弹性蛋白酶活力的影响　研究酶对温度（２２～７５℃）的　消化酶在组织器官中的分布。　可通过水解琥珀酰（丙氨酸）　耐受力，将鲑鱼和哺乳动物的　在国外，有关弹性蛋白酶的研　３对硝基苯胺（Ｓｕｃ—ＡＡＡ—ｐＮＡ）　弹性蛋白酶分别在一定的ｐｈ值　究较国内多且深入。Ｇｉｌｄｂｅｒｇ　的催化效率来测定。将鱼类和　（２．０～１０．５）条件下温浴１０分　Ａ等（１９９０）分离纯化北大西洋　猪的胰弹性蛋白酶做比较，科　钟，随即在冰上冷却，然后在　鳕鱼的胰弹性蛋白酶，并就底　研人员发现两种酶均在较广的　ｐｈ值为２．０和２２￣Ｃ条件下用人工　物特异性、催化效率和稳定性　ｐｈ值范围内保持了催化能力，　底物测残留酶活力，发现鲑鱼　与猪的胰弹性蛋白酶做了比较　但是鱼类耐受酸的能力较差。　弹性蛋白酶在所有上述ｐｈ值条　研究。Ｓｍｉｎｅ　Ａ等（１９９５）从角　有个别种属表现出突出的酸碱　件下，活性较哺乳动物弹性蛋　《北京水产》２００８第３期总第１１２期２７　维普资讯 http://www.cqvip.com

科普天地　白酶低；两种酶在中性和碱性条　化效率是猪的胰弹性蛋白酶的　报道说明，不同种属来源的胰弹　件下均比酸性条件下对温度的耐　２．５倍。综合来自鱼类和哺乳动物　性蛋白酶对抑制剂的敏感程度不　受力要高。　的胰弹『生蛋白酶动力学参数，尽管　同，存在差异。　２．２胰弹性蛋白酶底物专一性　催化效率各不相同，但鱼类胰弹性　２．４胰弹性蛋白酶相对分子质　和动力学参数及比较研究　蛋白酶拥有比哺乳动物胰弹性蛋　量和等电点的研究　底物浓度对胰弹性蛋白酶水　白酶更高的催化效率。　鱼类胰弹性蛋白酶的相对分　解速度的影响可用米氏常数　２．３抑制剂影响胰弹性蛋白酶　子质量一般是通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶　（Ｋｍ）来表示。它是酶的特征性　活力的研究　电泳测定。硬骨鱼类胰弹性蛋白　常数，Ｋｍ值越小，酶与底物的亲　胰弹性蛋白酶的抑制剂属于　酶的相对分子质量为２４—２９ＫＤａ。　和力越大。将来自于鼠、猪、鲑　丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，是一　Ｂｅｒｇｌｕｎｄ　ＧＩ等测得大西洋鲑的　鱼的胰弹性蛋白酶做比较，水解　种能够降低胰弹性蛋白酶活力的　胰弹性蛋白酶相对分子质量为２７　一系列人工底物Ｓｕｃ—ＡＡＰＸ—ｐＮＡ　物质。以大西洋鲑鱼，鳕鱼和角　ＫＤａ、大西洋鳕鱼２４．８ＫＤａ、欧洲　（ｘ＝ａ一氨基酸）。结果表明，鱼　鲨为例，其弹性蛋白酶活性能被　鲇鱼２４　ＫＤａ、Ｄｏｖｅｒ　ｓｏｌｅｌ９．５　类弹性蛋白酶针对Ｐ１位置表现出　丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氯　ＫＤａ。甲壳动物、哺乳动物和禽　亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基　（ＰＭＳＦ）、抑弹性蛋白酶醛　类的胰弹性蛋白酶分子质量也在　酸偏好性。将来自于鲑鱼、鳕　（Ｅｌａｓｔａｔｉａｎ１）和ＭＰＣＭＫ强烈抑　这个范围，如测得中国鲎胰弹性　鱼、虹鳟鱼、金鱼、猪、鼠的　制，表现出丝氨酸蛋白酶家族成　蛋白酶相对分子质量为２８．５　胰弹性蛋白酶做比较，水解人工　员的共有特征。但是苯甲脒、牛　ＫＤａ，智人２６．３ＫＤａ，鼠２９ＫＤａ，　底物Ｓｕｃ—Ａ从一ｐＮＡ，其中Ｋｍ值　胰蛋白酶抑制剂（ＢＰＴＩ）和亮肽　牛２９ＫＤａ，绵羊２５ＫＤａ，鸡２５　（ｒａＭ）分别为１．４７、１．０２～　素等胰蛋白酶特异性抑制剂对大　ＫＤａ。　１．９６、２．２、１．２、２．９９、１．０９～　西洋鲑鱼胰弹性蛋白酶活力却无　总结许多学者的研究报道，　２．０。Ｋｃａｔ值（Ｓ一１）分别为　明显影响，这又表现出弹性蛋白　鱼类胰弹性蛋白酶的等电点一般　３．５、３８．５～４４．５、１８４、４．１６、　酶与其他丝氨酸蛋白酶家族成员　在６～９．５范围内。如测得大西洋　２．８、１．５９～６．２。Ｋｃａｔ／Ｋｍ值分　的性质差异。　鲑的胰弹性蛋白酶ＰＩ大于９．３、　别为２．４、１９．６～４３．２、８３．６、　Ｌ一半胱氨酸，一种金属离　大西洋鳕鱼９．３、Ｄｏｖｅｒ　ｓｏｌｅ　３．５、０．９、１．４６～３．１。综合上　子螯合剂和巯基阻断剂，对鱼类　５．７。所以，在中性条件下，绝　述数据，可知同样条件下测得的　和哺乳动物胰弹性蛋白酶均有抑　大部分胰弹性蛋白酶都属于中性　鲑鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、金鱼胰　制效应。但是二价金属离子螯合　偏碱性蛋白酶，只有个别鱼类胰　弹性蛋白酶的Ｋｍ值相近，却比猪　剂ＥＤＴＡ对鱼类和哺乳动物的胰弹　弹性蛋白酶为弱酸性，如欧洲鲇　的Ｋｍ值小了近一倍，鲑鱼胰弹性　性蛋白酶均无明显抑制效应。体　鱼胰液纯化得出的两种带电不同　蛋白酶Ｋｃａｔ值（转化率）较猪的　现了不同种属来源的胰弹性蛋白　的胰弹性蛋白酶亚型的Ｐ１分别为　胰弹性蛋白酶Ｋｃａｔ值高，从而　酶的共性。通过比较，发现鱼类　６．１７／８．４８，一种属于碱性胰弹　Ｋｃａｔ／Ｋｍ值（催化效率）比猪的　胰弹性蛋白酶比哺乳动物胰弹性　性蛋白酶，而另外一种属于弱酸　胰弹性蛋白酶Ｋｃａｔ／Ｋｍ｛￣｛高了　蛋白酶对ＰＭＳＦ更敏感；碘乙酰　性胰弹性蛋白酶。　２．５倍。结果表明，四种鱼类胰　胺，一种巯基改良剂，对鱼类胰　弹性蛋白酶与底物Ｓｕｃ—Ａ从一　弹性蛋白酶无影响，却对哺乳动　蔟统进化分析　ｌ嚣　‘　０　ｐＮＡ的亲和力相近，但要比猪胰　物胰弹性蛋白酶有轻微抑制效　哺乳动物包括猪、鼠、人的　弹性蛋白酶的底物亲和力小；大　应；大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制　弹性蛋白酶氨基酸序列测定已经　西洋鲑鱼的弹性蛋白酶作为一种适　鳕鱼胰弹性蛋白酶活力，对猪胰　完成，编码区分别由２６６、２６６、　冷酶为了适应低温的生活环境，催　弹性蛋白酶活力却无影响。上述　２６９个氨基酸残基组成，具有较　２８《北京水产》２００８９３期总第１１２期　维普资讯 http://www.cqvip.com 科普天地≤　高的同源性。鱼类与哺乳动物的　胰弹性蛋白酶氨基酸组成存在相　似性，但无论是残基数目还是组　与其他硬骨鱼如鳕鱼、鲑鱼和哺　乳动物如鼠以及人的胰丝氨酸蛋　白酶基因构建系统进化分析，从　构建的进化树得知日本比目鱼胰　蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶基因　谱的蛋白水解活性，不仅在医药　工业，而且在食品工业、日化工　业上也有着广阔的应用前景和较　高的商业价值。较高活性胰弹性　蛋白酶的提取利用，还有利于水　产品加工过程中废弃物的充分利　成上都存在差异。登陆ＧｅｎＢａｎｋ　能搜索到大西洋鲑鱼和日本比目　鱼弹性蛋白酶编码区完整序列信　和弹性蛋白酶基因的首次倍增与　息，分别由１８１和２６６／２６８（ＥＬ１／　硬骨鱼、哺乳动物胰丝氨酸蛋白　用。在众多蛋白质水解酶中，胰　ＥＬ４两个亚型）个氨基酸残基组　酶基因构成的簇的首次倍增发生　弹性蛋白酶的年消耗量占酶制品　成。将角鲨的两种胰弹性蛋白酶　在同时期。硬骨鱼弹性蛋白酶基　世界市场的比例逐年上升。　亚型ＥＩ和ＥＩＩ的氨基端序列（各　因与哺乳动物弹性蛋白酶的分歧　胰弹性蛋白酶的纯化及其特　２０个残基）与人和鼠的胰弹性蛋　时间要晚于首次倍增。因此，可　性的研究，不仅有助于了解胰弹　白酶编码区氨基酸序列进行比　以得知胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶　性蛋白酶结构与功能的关系，而　对，具有８５％的同源性。两栖动　和弹性蛋白酶的首次倍增早于硬　且有助于探究鱼类的消化生理特　物中非洲爪蟾的编码区由２６４个　骨鱼类的分化。　点，为水产饲料的设计提供理论　氨基酸残基组成。　４小结ｊ　。　。。¨　依据，为确立鱼类适宜养殖条件　生物进化分析是生物信息学　弹性蛋白酶是广泛应用于医　提供基础数据。但是到目前为　的一个分支。它通过对生物序列　药工业、食品工业、畜牧业和现　止，鱼类胰弹性蛋白酶的研究在　的研究推测物种的进化历史。主　代生物技术领域的一种非常重要　国内还处于刚刚起步的阶段，迫　要通过ＤＮＡ序列，蛋白质序列，　的酶。目前，弹性蛋白酶主要作　切需要对胰弹性蛋白酶的基础理　蛋白质结构等来构建分子进化树　为治疗高血脂症、防止动脉粥样　论进行更加深入透彻的研究，使　或者种系发生树。将日本比目鱼　硬化的生化药物。同时由于其广　该研究领域赶超世界先进水平。　（上接３４页）　心卡帕藻不适宜在河口海区进行栽培，因为河口区　１．１３％增２１３．３个百分点，其生长速度明显增加。本　海水盐度变化幅度较大，尤其在暴雨季节对长心卡　实验在封闭式的水族箱中进行，营养盐始终能被藻　帕藻的生长会造成直接的影响，如海水比重长时间　体充分和有效利用，而在海区施肥，因海水流动性　低于１．０１５以下，藻体会出现颜色变淡、发软和腐　大，显然有一部分肥料流失，因此本实验营养盐的　烂。因此，栽培长心卡帕藻的海区必须选择在海水　利用率要比在自然海区高一些。　流畅的地方，这样可以避免淡水大量流入。　参考文献　氮肥是影响海藻生长的主要因素，长心卡帕藻　…１匡梅，曾呈奎，夏邦美．中国麒麟菜族的分类研究Ⅱ］．海洋　对三氮的吸收顺序是ＮＨ４－Ｎ、ＮＯ３－ＮＨ和ＮＯ２－Ｎ，本实验　科学集刊，１９９９，４１：１６８－２３６．　结果表明施用铵态氮营养盐比施用硝态氮营养盐生　【２吴超元，２］李家俊，夏恩湛，冯作圣，谭塾之，李钧，温宗　长速度要快，这与吴汪黔生的实验大体相同　。当　存，黄晓航．异枝麒麟菜的移植和人工栽培Ⅱ１’海洋　ｐｈ值高时，海藻原生质膜易吸收阳离子，当ｐｈ值低　与湖沼，１９８８，１９（５）：４１０－－４１７，　时，易吸收阴离子，ｐｈ值增高氮吸收量少而铵　【３】吴汪黔生，高洪峰，丁美丽，谢玉坎，张口，钱培元，吴　氮吸收量多。　。本实验ｐｈ值为７．８～８．１，因而容易　超元．合浦珠母贝代谢产物对异枝麒麟菜生长的　吸收碳酸氢铵和硫酸铵营养盐。　促进作用硼，海洋与湖沼，１９９７，２８（５）：４５３－４５７．　本实验碳酸氢铵的平均日增重为１７．３５ｇ，平均　【４】曾广兴　异枝麒麟菜养殖人工施肥试验初报［『】．科　日生长率为４．４５％；比曾广兴的平均日生长率　学养鱼，２００１（１０）：４３，　《北京水产》２００８第３期总第１１２期２９