福建农业学报２７（２）：１４９～１５２，２０１２ Ｆｕｊ ｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１Ｄ０８—０３８４（２０１２）０２—１４９—０４ 林戎斌，张慧，林陈强，等．ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的应用比较ＥＪ］．福建农业学报，２０１２，２７（２） １４９—１５２． ＬＩＮ Ｒ—Ｂ，ＺＨＡＮＧ Ｈ，ＬＩＮ Ｃ－Ｑ，ｅｔ ａ１．ＤＮＡ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ ＥＪ］ Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２７（２）：１４９—１５２． ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的 应用比较 林戎斌，张 慧，林陈强，郑 力，陈济琛 （福建省农业科学院士壤肥料研究所，福建福州 ３５００１３） 摘要：利用ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ３种分子标记法对１６株姬松茸菌株进行比较分析。结果表明其中８条 ＲＡＰＤ、４条ＩＳＳＲ和２对ＳＲＡＰ引物适合姬松茸菌株鉴定分析，３种标记方法均将１６个菌株分为３大类群， ＡＯＯｌｌ＋１和ＡＯＯ１３为１类，Ａ０００９单独为１类，其余菌株为１类。３种分子标记法对姬松茸菌株鉴别的结果存 在着一定差别。ＳＲＡＰ反应的遗传信息较丰富，比ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ检测到更大的遗传差异；ＲＡＰＤ引物扩增到的 多态性条带数较多。 关键词：姬松茸；随机扩增多态性；简单序列重复多态性；相关序列扩增多态性；聚类分析 中图分类号：Ｑ ３４４．１ 文献标识码：Ａ ＤＮＡ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ ＬＩＮ Ｒｏｎｇ－ｂｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ，ＬＩＮ Ｃｈｅｎ－ｑｉａｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｊｂｃｈｅｎ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ，ＦｕＪｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆ ｉａｎ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｉｘｔｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ＩＳＳＲ，ＲＡＰＤ ａｎｄ ＳＲＡＰ．ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ８ ＲＡＰＤ ｐｒｉｍｅｒｓ．４ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ２ ＳＲＡＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ．Ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ Ａ００１ １＋１ ａｎｄ Ａ００１３，ａｎｏｔｈｅｒ Ａ０００９，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｒｏｕｐ ｔｈｅ ｒｅｍａｉｎｄｅｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳＲＡＰ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｒｉｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ＲＡＰＤ ｐｒｉｍｅｒｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ ａｍｏｎｇ ａｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ；ＲＡＰＤ；ＩＳＳＲ；ＳＲＡＰ；ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ 姬松茸Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ又名巴西蘑菇、 析１２个白色金针菇菌株的遗传特性及亲缘关系。 柏氏蘑菇、小松菇，属担子菌门，伞菌纲，伞菌 朱坚等 研究表明ＳＲＡＰ可应用于金针菇的杂交 目，蘑菇科，蘑菇属。姬松茸具有浓郁的杏仁香 育种，指导亲本选择与杂种鉴定。张红玉等 发现 味，菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用 ｓＲＡＰ分子标记技术可以用于灵芝原生质体融合子 价值颇高，其营养价值也很高。此外，因含有多种 的鉴定。郭钟尧等［７］，熊芳等 ］、李翠翠等 利用 抗肿瘤活性物质，其干品可提取加工为姬松茸多 ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分别对金针菇、凤尾菇、真姬菇 糖、姬松茸胶囊、姬松茸冲剂等系列产品，用于治 菌株进行遗传多样性分析。陈美元等【１叩利用ＩＳＳＲ 疗癌症、糖尿病、神经痛、肝病，降低高血脂，改 和ＳＲＡＰ分子标记技术对蘑菇菌株进行遗传多样 善动脉硬化等［】］，是一种珍稀食药两用菌［２］。 性分析。孙淑静等ｒ１ 利用ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ分子标 国内已有利用分子标记技术对食用菌遗传多样 记技术分析了不同来源的１４株银耳芽孢多样性。 性进行分析的报道。尚晓冬等 利用ＲＡＰＤ分子 本研究利用ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ、ＳＲＡＰ３种分子标记技 标记技术对国内外收集到的１９株杏鲍菇进行指纹 术对１６个姬松茸菌株的亲缘关系进行分析比较， 图谱分析；崔鹏等＿４ 利用ＲＡＰＤ分子标记技术分 对姬松茸遗传育种工作具有一定的实用价值。 收稿日期： ２０１１—１１－－０９初稿；２０１２一Ｏ２一Ｏ１修改稿 作者简介： 林戎斌（１９７１一），男，硕士，副研究员，主要从事食用菌研究（Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｎｇｂｉｎｌｉｎ２００１＠１６３．ｃｏｍ） 通讯作者： 陈济琛（１９６４一），男，研究员，主要从事农业微生物与食用菌研究（Ｅ－ｍａｉｌ：ｅｈｅ￣ｉｅｈｅｎ２００１＠１６３．ｃｏｍ） 基金项目： 福建省科技计划重点项目（２０１０Ｙ１００４、２０１１Ｙ１００４）；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队项目（ＳＴＩＦ－Ｙ０１） １５０ 福建农业学报 第２７卷 １材料与方法 １．１供试菌株 ＡｂＭＬ２、ＡｂＭＤ３、ＡｂＭＬ７、ＡｂＭ９、ＡｂＭＬ１１菌 献［１１］的方法进行。 １．６．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增与检测 扩增方法参照文 献［１３３的方法进行。 １．６．３ ＳＲＡＰ标记扩增与检测 扩增方法参照文 株由福建省农业科学院土壤肥料研究所保藏，其余 菌株由福建省农林大学菌物研究中心提供（表１）。 １．２培养基 献［１４］的方法进行。 １．７数据分析 利用ＤＰＳ６．０１分析软件体系进行聚类，构建 遗传相关聚类图谱。 表１供试姬松茸菌株 Ｔａｂｌｅ １ Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ 试管斜面培养基：马铃薯２００ ｇ、葡萄糖２０ ｇ、 琼脂２０ ｇ、水１ ０００ ｍＬ。液体ＰＤＡ培养基：马铃 薯２００ ｇ、葡萄糖２０ ｇ、水１ ０００ ｍＬ。 １．３试剂与仪器 脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ，２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ ）、 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ Ｕ・ Ｌ ）；ＰＣＲ引物序列见表 ２。ＰＣＲ扩增仪：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ２２３３１ Ｈａｍｂｕｒｇ；电 泳仪：Ｄ－ＹＹ一１２型电脑三恒多用电泳仪；凝胶成像 系统：ＴＡＮＯＮ－２００８。 １．４菌丝体培养 将冰箱保种菌种接于试管斜面培养基，转管活 化７～１０ ｄ，耙碎，接入２５０ ｍＬ三角瓶液体培养基 中，每个菌株各接３瓶，于２５℃摇床上１２０ ｒ・ｍｉｎ 培养１０ ｄ，用４００目铜网过滤，蒸馏水冲洗，滤纸 吸干，保存于一２０℃备用。 １．５ ＤＮＡ提取 取姬松茸菌丝０．５ ｇ，参照文献［１２］的 ＣＴＡＢ法进行ＤＮＡ提取。 １．６分子标记反应体系及电泳条件 １．６．１ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增与检测 扩增方法参照文 表２ ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ引物 Ｔａｂｌｅ ２ ＲＡＰＤ，ＩＳＳＲ ａｎｄ ＳＲＡＰ ｐｒｊｍｅｒｓ ２结果与分析 ２．１ ＳＲＡＰ扩增结果分析 筛选得到２对ＳＲＡＰ引物（ｍｅ２￣ｅｍｌ２、ｍｅ１～ ｅｍｌ３），其在１６株供试菌株上扩增效果较好（图 ＮＡ性Ｄ好， 莩妻 为２７３条，多态性条带为１０５条，占总条带数的 ３８．５ 。 １５２ ２．４ 聚类分析 福建农业学报 第２７卷 ０．４５、０．４０、０．８０时，均将供试的１６个姬松茸菌 ｌｌ ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ标记方法菌株间相似系数分别在 二］１ ｌ根据１６个菌株的遗传距离进行聚类。ＳＲＡＰ、 株划分为３大类群，Ａ００１１＋１和Ａ００１３为一类， Ａ０００９单独为一类，其余菌株为一类。 ｈ ｌ ＿－Ｊ广］ ｈ Ｉ ｌ 二卜 １．００ ０．８０ ０．６０ ０４ｏ ０．２０ Ｏ ０ ０．１５ ０．３０ ０．４５ ０６０ ０．７５ Ａ．ＳＲＡＰ聚类分析树状图 Ｂ．ＲＡＰＤ聚类分析树状图 ｃ．ＩＳＳＲ聚类分析树状图 图４ １６个姬松茸菌株ＩＳＳＲ聚类分析树状图 Ｆｉｇ．４ Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ １ ６ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａ．ｂｌａｚｅｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＲＡＰ。ＲＡＰＤ ａｎｄ ＩＳＳＲ ［３］尚晓冬，宋春艳，沈学香，等．杏鲍菇菌株ＲＡＰＤ指纹图谱 ３ 讨 论 本研究利用３种分子标记技术ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ、 分析［Ｊ］．食用菌学报，２００９，１６（３）：１—４． ［４］崔鹏，张树斌，李冬梅，等．１２个白色金针菇菌株的亲缘关 系分析［Ｊ］．食用菌，２０１０，（６）：１７—１９． ［５］朱坚，高巍，林伯德，等．金针菇种质资源的ＳＲＡＰ分析［Ｊ］．福建 农林大学学报：自然科学版，２００７，３６（２）：１５４—１５８． ＲＡＰＤ对姬松茸栽培菌株进行分析，均将１６个菌 一 株分成３组，其中ＡｂＭＤ３菌株为ＡｂＭ９单孢分离 获得，遗传相似系数最高＿１ ，ＳＲＡＰ标记方法聚类 分析结果与其相一致，ＩＳＳＲ分子标记结果与其有 差异，ＲＡＰＤ方法分析结果介于两者之间；３种分 子标记结果中Ａ０００９菌株与其他菌株均有较大的 遗传差异，Ａ００１１＋１和Ａ００１３菌株与其他菌株也 有较大的遗传差异，Ａ０００９、Ａ００１１＋１和Ａ００１３ 菌株分别来源于东北食药真菌研究所、山东省寿光 ［６］张红玉，付立忠，吴学谦，等．灵芝原生质体融合子的ＳＲＡＰ 分子标记鉴定［Ｊ］．食用菌学报，２００９，１６（４）：５—９． Ｅ７］郭钟尧，姜辉，贾培培，等．ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记在金 针菇菌种鉴定中的应用［Ｊ］．食用菌，２０１１，（２）：１５—１７． ［８］熊芳，郑闽江，刘新锐，等．利用ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ建立快速 鉴定风尾菇菌株的ＳＣＡＲ标记［Ｊ］．江西农业大学学报， ２０１０，３２（３）：６０１—６０７． ［９］李翠翠，郭立忠，卢伟东，等．ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记在真姬 菇菌种鉴定中的应用［Ｊ］．食用菌学报，２００９，１６（１）：２ｌ一２５． ［１Ｏ］陈美元，廖剑华，王波，等．中国野生蘑菇属９Ｏ个菌株遗传多样 性的ＤＮＡ指纹分析口］．食用菌学报，２００９，１６（１）：ｌ１—１６． 市食用菌研究所和湖北省嘉鱼县环宇食用菌研究 所，可为以后姬松茸杂交选育的亲本选择上提供参 考和依据。 从本试验所采用的３种分子标记法对姬松茸菌 ［１１］孙淑静，林喜强，谢宝贵，等．银耳芽孢遗传多样性分析 ［Ｊ］．热带作物学报，２００９，３０（９）：１３０８—１３１３． ［１ｅ］王关林，方宏筠．植物基因工程：第２版［Ｍ］．北京：科学 出版社，２００２：７４４． 株鉴别的结果可知，它们之间存在着差别。ＳＲＡＰ 标记应用于姬松茸菌株鉴定较ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ检测 到更大的遗传差异。 参考文献： ［１］史刚荣．姬松茸研究的现状和展望ＥＪ］．江苏食用菌，１９９５， １６（４）：２１—２２． ［１３］林新坚，江秀红，蔡海松，等．姬松茸ＩＳＳＲ特异扩增体系的 研究［Ｊ］．食用菌学报，２００７，１４（３）：２４—２８． Ｄ４］应正河，吴小平，谢宝贵，等．香菇ＳＲＡＰ反应体系的优化 ［Ｊ］．食用菌学报，２００６，１３（４）：１—５． ［１５］张慧，江秀红，林新坚，等．离子束选育姬松茸新菌株的鉴 定［Ｊ］．食用菌学报，２０１０，１７（３）：１６—１９． ［２］卯晓岚．中国大型真菌［Ｍ］．郑州：河南科学技术出版社， ２０００． （责任编辑：柯文辉）