生！ 箜 鲞筮 期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｊｕｌｙ ２０１４，Ｖｏ１．１５，Ｎｏ．４ ・３３７・ ・论著・ 不同质量精子线粒体ＤＮＡ拷贝数 及完整性的比较研究 孙志敏 彭红梅 赵恩锋 穆莎 马憋悦 温春燕 唐结 【摘要】 目的 探讨精子线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）拷贝数与完整性与男性不育的相关性。方法 选取正常 精液样本１８例，异常精液样本３４例，采用Ｐｅｒｃｏｌｌ液密度梯度离心将样本分为３Ｏ 层和８Ｏ 层精子，并采用实 时荧光定量ＰＣＲ技术测定精子ｍｔＤＮＡ拷贝数及长链ＰＣＲ技术测定ｍｔＤＮＡ完整性。结果在８Ｏ 层精子中， 少精子症组ｍｔＤＮＡ拷贝数［（１．５２±０．６８）个］和少弱精子症组［（１．９３±０．６５）个］与正常组［（ｏ．８０±０．４５） 个］比较，差异有统计学意义（Ｐ＜ｏ．０１）；少弱精子症组ｍｔＤＮＡ完整性（０．９３±０．２７）与正常组（２．７０＋１．７４）、 弱精子症组（３．２４±２．１８）及少精子症组（１．７６±０．７６）比较，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。在３Ｏ％层精子 中，少精子症组ｍｔＤＮＡ拷贝数（１３．３３±９．９６）和弱精子症组（１．９２±１．２９）与正常组（４．８５土３．００）比较， 差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论可能成为预测精子质量的一个指标。 质量差的精子中存在ｍｔＤＮＡ拷贝数增加及完整性减弱，ｍｔＤＮＡ的检测 【关键词】 线粒体ＤＮＡ；男性不育；精子；ＤＮＡ拷贝数；ＤＮＡ完整性 Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｐｅｒｍ ＳＵＮＺｈｉｍｉｎ，ＰＥＮＧＨｏｎｇｍｅｉ，ＺＨＡＯＥｎｆｅｎｇ，ＭＵＳｈａ，ＭＡＭｉｎｙｕｅ，ＷＥＮＣｈｕｎｙａｎ，ＴＡＮＧＺｈｅ． （Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５３，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ），ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｒｍ ｍｔＤＮＡ ａｎｄ ｍａｔｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａ— ｔｉｏｎ，ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｏｔｉｌｅ ｓｐｅｒｍ ｆｒｏｍ １８ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ３４ ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｐｅｒｍ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｌｏｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ３Ｏ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｌａｙｅｒｓ ｔｈａｎ ｔｈｅ ８Ｏ ｌａｙｅｒｓ ｉｎ ５２ ｓｐｅｒｍ ｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｉｎ ｔｈｅ ８０ ｌａｙｅｒｓ，ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｉｎ ｍｔＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（１．５２±０．６８）ａｎｄ ｏｌｉｇｏａｓｔｈｅｎｏｚｏｏｓｐｅｒｒｎｉａ（１．９３±Ｏ．６５） ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｍｅｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｏ．８０±０．４５，Ｐ（０．０１）．ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｍｔＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｌｉｇｏａｓｔｈｅｎｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（Ｏ．９３＿ｉ－０．２７）ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｍｅｎ（２．７０±１．７４），ａｓ— ｔｈｅｎｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（３．２４±２．１８）ａｎｄ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（１．７６±Ｏ．７６，Ｐ（Ｏ．０１）．Ｉｎ ｔｈｅ ３０ ｌａｙｅｒｓ，ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｒｏｍ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（１３．３３±９．９６）ａｎｄ ａｓｔｈｅｎｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ（１．９２＋１．２９）ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｍｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ（４．８５±３．００。Ｐ＜Ｚ０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｍｔＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｐｏｏｒ ｓｐｅｒｍ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｗｅ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｍｔＤＮＡ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｍａｙ ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ；ｍａｌｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ；ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ；ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ；ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，２０１４，１５：３３７—３４０ 线粒体是精子中唯一的细胞器，通过氧化磷酸 化产生ＡＴＰ供给精子能量。虽然线粒体产能对精 子运动和功能的重要性还存争议［ ，但已发现异常 精液中存在线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）突变与缺失及 ｄｏｉ：１０．１３３９０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—１８６１．２０１４．０４．０１４ 精子结构的异常［２］。近年来，精子ｍｔＤＮＡ拷贝数 与男性不育的关系已经引起关注，有学者提出通过 测定精子ｍｔＤＮＡ拷贝数评估线粒体功能的假 设［３］。本研究收集本院５２例不同质量的精液样本， 采用实时荧光定量砌 技术测定精子ｍｔＤＮＡ拷贝数 及长链ＰＣＲ技术测定ｍｔＤＮＡ完整性，探讨ｍｔＤＮＡ 作者单位：１００８５３北京解放军总医院妇产科生殖医学中心 通信作者：彭红梅Ｅｍａｉｌ：ｐｈｍｅｉｚｙｓ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ 中国妇产科临床杂志２０１４年７月第１５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｊｕｌｙ ２０１４，Ｖｏ１．１５，Ｎｏ．４ 与精子质量的相关性，以促进男性生育的研究。 资料与方法 一、研究对象 选择２０１３年１０月至２０１４年１月解放军总医 院生殖中心因不孕不育行门诊精液检查患者５２例， 其中正常精液１８例，异常精液３４例。患者年龄 （３１．６７±３．９４）岁。排除性腺功能低下、睾丸发育 异常、输精管梗阻和白细胞精子症等精液。 二、取材方法 禁欲３～５ ｄ，手淫法留取精液样本于洁净容器 中，置于３７℃恒温环境中。在１ ｈ内经计算机辅 助精子分析系统（ＣＡＳＡ）完成数据采集。 三、分组 根据２０１０年ｗＨＯ颁布的第５版《世界卫生 组织人类精液实验室检验手册》＿４］将精液样本分为 ４组：正常组（精子前向运动＞３２ 且精子浓 度＞１５×１０ ／ｍ１）、弱精子症组（精子前向运动＜ ３２ ）、少精子症组（精子浓度＜１５×１０。／ｍ１）、少 弱精子症组（精子浓度＜１５×１０ ／ｍｌ且前向运 动＜３２ ），５２例患者的情况见表１。 表１各组精液样本的一般资料 ± ） 四、方法 １．主要试剂和仪器：Ｐｅｒｃｏｌｌ液购自美国ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司，ｍｔＤＮＡ提取相关试剂、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ核酸染料荧光试剂盒、寡核苷酸引物均购自 北京康为世纪公司。实时荧光定量ＰＣＲ仪（美国 ＡＢＩ公司，型号７５００）；ＰＣＲ仪（杭州博日公司）； 微光分光光度计（美国赛默飞世尔科技，型号 ２０００）；全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能 公司，型号１６００）。 ２．密度梯度离心法制备不同活力精子：向离 心管中依次加入８０ 、３Ｏ Ｐｅｒｃｏｌｌ液各１ ｍｌ，形 成明显分界面的Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度层；将１ ｍｌ混匀后液 化精液加入密度梯度液上方，以５００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ。吸出上清层、３０ 层和８０ 层的精子，１０ 倍体积的ＰＢＳ清洗精子，３００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ， 重复清洗离心，镜下观察各层精子活力。 ３．柱式提取精子ｍｔＤＮＡ：将精液１０ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，弃尽上清，加２００／ＡＧＴＬ和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，振荡，加人２０ ｌ蛋白酶Ｋ，涡旋 震荡后５６℃水浴６０ ｍｉｎ，加入２００ ｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＬ， 涡旋震荡。再加入２００ １无水乙醇，涡旋震荡后 装入收集管的吸附柱中，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ， 倒掉废液。加入５００ ｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＷ１，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１ ｍｉｎ，加入５００ １ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＷ２，１０ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，再１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｍｉｎ，均弃 掉废液，室温放置５ ｒａｉｎ，再加入５０ ｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＧＥ， 室温放置５ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心ｌｍｉｎ，收集 ＤＮＡ溶液，分光光度计测定浓度，一２Ｏ℃保存。 ４．引物设计：参考Ｋａｏ等［５］的实验进行ｍｔＤ— ＮＡ拷贝数检测用引物的设计。ＮＤ１引物：扩增代 表精子总ｍｔＤＮＡ数量的９９ ｂｐＰＣＲ产物；ＡＣＴＢ 引物：扩增精子核基因组中的』３一ａｃｔｉｎ基因，代表 精子数量的１１９ ｂｐＰＣＲ产物。具体引物：ＡＣＴＢ— Ｆ：５’一ＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴ一３’，ＡＣＴＢ— Ｒ：５’一ＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ一３’， ＮＤ１一Ｆ：５’一ＴＣＴＣＡＣＣＡＴ￣ＣＴＴＣＴＡＣＴ一３’， ＮＤ１一Ｒ：５’一Ａｆ Ｉ （ Ａ‘ Ｉ ｌ （ ＡＡｌ Ａ一３ 。 检测精子ｍｔＤＮＡ完整性的引物按照Ｓｏｎｇ等ｌ＿６］的 设计，采用长链ＰＣＲ技术，扩增８．７ ｋｂ的线粒体 基因，包括４．９ ｋｂ和７．４ ｋｂ缺失基因。引物序 列：Ｆ：５’一ＡＡＧＧＡ＝ｒＣＣ１‘Ｃ Ｉ、ＡＧＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＡ— ＡＡＧ一３’，Ｒ：５’一ＴＴＧＧＡｒ℃ＣＡＧＴＧＣｐ（ＩＡＣ（Ｘ 一 ＣＡＡＡＡＧ一３’。 ５．实时荧光定量ＰＣＲ技术分析精子ｍｔＤＮＡ 拷贝数：采用ＵｌｔｒａＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ试剂盒在定量 ＰＣＲ仪上测定ｍｔＤＮＡ拷贝数。根据试剂盒说明 书制备２Ｏ Ｕ１ ＰＣＲ反应混合物。ＰＣＲ反应条件： ９５℃预变性１０ ｍｉｎ，９５℃变性１５ｓ，６０℃退火／ 延伸１ ｍｉｎ，共４Ｏ个循环。设定融解曲线（６０～ ９５℃），检测ＰＣＲ反应特异性。每个样品重复３ 次测量。 ６．长链ＰＣＲ技术检测精子ｍｔＤＮＡ完整性： 在标准条件下运行ＰＣＲ反应，反应体系为５Ｏ ｌ， 含１Ｏ×Ａｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ ｌ，ｄＮＴＰ ｍｉ×４ ｌ， ５×Ｃ—Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ ｌ，ＬＡｍｐ ＤＮＡ酶０．５ ｌ，上、 下游引物各２“１，ＤＮＡ模板２００ ｎｇ。ＰＣＲ反应条 件见文献［－６－１。ＰＣＲ产物通过１．５ 琼脂糖凝胶电 泳后，在全自动数码凝胶图像分析系统下获得图 中国妇产科临床杂志２０１４年７月第１５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｊｕｌｙ ２０１４，Ｖｏ１．１５，Ｎｏ．４ 拷贝数３Ｏ ９，６层较８０ ９／６层显著增加，在少精子症组， 其差异高达４９倍。说明在同一精液样本中，不同 活力的精子间ｍｔＤＮＡ拷贝数存在差异，活力越 差，ｍｔＤＮＡ拷贝数越多。其增加的原因被认为是 长期过量的活性氧（ＲＯＳ）刺激，引起线粒体呼吸 链功能受损，ＡＴＰ合成受到抑制，为了弥补损伤 后的功能缺陷，其拷贝数代偿性增加。线粒体是 ＲＯＳ的主要产生部位，少量适当的ＲＯＳ有助于精 子获能和顶体反应［１州，但当ＲＯＳ的产生超过了抗 氧化系统的清除与防御能力时，就会导致损伤。另 外，异常分化与成熟的精子拷贝数会增加［８３。同时 也不排除３Ｏ 层存在少量杂质的影响。 二、ｍｔＤＮＡ完整性分析 人类ｍｔＤＮＡ是含有１６ ５６９个碱基的双链闭 合环状结构，编码呼吸链氧化磷酸化复合体中１３ 条多肽链及线粒体蛋白质合成所需的２２种ｔＲＮＡ 和２种ｒＲＮＡ基因。目前研究发现精液中存在 ｍｔＤＮＡ的缺失与突变＿２］。本研究发现，ｍｔＤＮＡ 完整性在质量差的精子中显著降低，与Ｓｏｎｇ等＿＿６］ 的结论基本一致，不同之处在于后者得出ｍｔＤＮＡ 强度的平均值为５１．１，这与本研究的结果差异较 大。可能的原因：一是样本的选择标准不同，本研 究根据２０１０年ｗＨＯ的标准选择精子样本；二是 本研究对样本进行了分层分析；三是所用的仪器设 备的差异。但两者结果一致，即少弱精子症组的 ｍｔＤＮＡ完整性较正常组、弱精子症组及少精子症 组显著降低。 对于精子制备方法的选择，ＷＨＯ的意见是在 严重少精子症、畸精子症或弱精子症，选择密度梯 度法，可以回收到更多的活动精子＿４］。虽然Ｐｅｒ— ｃｏｉｌ已不在临床使用，但在精子的基础研究中还普 遍应用ｌ＿１ｊ。并且目前没有文献报道显示Ｐｅｒｃｏｌｌ对 精子ｍｔＤＮＡ有损伤。 总体来说，质量差的精子中存在ｍｔＤＮＡ拷贝 数的增加及完整性减弱。目前普遍认为线粒体通过 氧化磷酸化供给精子能量，但也有学者提出了糖酵 解参与精子供能［】 ，在本研究中弱精子症组与正 常组活动精子ｍｔＤＮＡ完整性及拷贝数差异并不 大，因此有理由怀疑线粒体产能对精子运动和功能 的重要性。目前针对男性不育的卵泡浆内单精子注 射技术（ＩＣＳＩ）使生育过程的某些阶段避开了自然 选择，也有可能回避了父系ｍｔＤＮＡ从胚胎中去除 的机制，ｍｔＤＮＡ疾病存在通过ＩＣＳＩ垂直传递给 后代的可能性。因此，研究精子ｍｔＤＮＡ十分重 要，更有助于了解线粒体与男性不育的关系。 参考文献 ［１］Ｐｉｏｍｂｏｎｉ Ｐ，Ｆｏｃａｒｅｌｌｉ Ｒ，Ｓｔｅｎｄａｒｄｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｅｎｅｒｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，２０１２，３５：１０９—１２４． ［２］Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ Ｃｏｌａｇａｒ Ａ，Ｋａｒｉｍｉ Ｆ Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ ａｓｔｈｅｎｏ，ａｓｔｈｅｎｏｔｅｒａｔｏ ａｎｄ ｏｌｉｇｏａｓｔｈｅ— ｎｏｔｅｒａｔｏ－ｓｐｅｒｍｉｃ ｍａｒ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ，２０１３．［ＥＢ／ＯＬ］． ［２０１４—０３—２ｏ］．ｄｏｉ：１０．３１０９／１９４０１７３６．２０１３．７９６５１２． ［３］ Ｍａｌｉｋ Ａ，Ｃｚ￣ｋａ Ａ Ｉｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａ ｐｏｔｅｎ— ｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ１ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ？Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ， ２０１３，１３：４８１—４９２． ［４］Ｔｒｅｖｏｒ ＧＣ．世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手 册．谷翊群，陈振文，卢文红，等译．北京：人民卫生出版 社，２０１１：２３３． ［５］ Ｋａｏ ＳＨ，Ｃｈａｏ ＨＴ，Ｌｉｕ ＨＷ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｒｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ａｓｔｈｅｎｏｓｐｅｒｍｉａ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ， ２００４，８２：６６—７３． ［６］ Ｓｏｎｇ ＧＪ，Ｌｅｗｉｓ Ｖ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｍｅｎ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，２００８，９０： ２２３８—２２４４． ［７］ Ｍａｎｆｒｅｄｉ Ｇ，Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ Ｄ，Ｐａｐａｄｏｐｏ／ｌｌｏｕ ＬＣ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｔＤＮＡ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１９９７，６１：９５３—９６０． ［８］Ｐａｎｌｏｕｐ Ｐ，Ｃｈｒｅｔｉｅｎ ＭＦ，Ｓａｖａｇｎｅｒ Ｆ．ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｐｅｒｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｍａｌｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００３，１８：５５０—５５６． ［９］ Ｒａｎｔａｎｅｎ Ａ，Ｌａｒｓｓｏｎ ＮＧ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｄｕｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ，２０００， １５：８６—９１． ［１Ｏ］Ｇｒｉｖｅａｕ ＪＦ，Ｌｅ Ｌａｎｎｏｕ Ｄ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｈｕ— ｍａｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ， １９９７，２０：６１—６９． ［１１］Ｓｈｗｅｔａ Ｂ，Ｖｅｅｎａ Ｄ，Ｄａｒｓｈａｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ａ—ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，２０１４，１０１：９５—１０４． （收稿日期：２０１４—０３—２８）