*CN102391960A*
(10)申请公布号 CN 102391960 A(43)申请公布日 2012.03.28
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110333534.2(22)申请日 2011.10.27(83)生物保藏信息
CGMCC NO.5102 2011.08.01
(71)申请人南京农业大学
地址210095 江苏省南京市卫岗1号南京农
业大学(72)发明人李引 李辉信 胡锋 刘满强
焦加国(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所
(普通合伙) 32204
代理人柏尚春(51)Int.Cl.
A01G 1/00(2006.01)C12R 1/06(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)C05G 3/00(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页
(54)发明名称
一种根际促生菌及其应用(57)摘要
本发明公开了一种根际促生菌及其应用，属于微生物领域，该根际促生菌（ArthrobacterchlorophenolicusL4），于2011年8
月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus），保藏号CGMCC No.5102。该菌株能高产吲哚乙酸并能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，高产的吲哚乙酸促进花生的生长发育，土壤有效磷含量的提高也使得花生对磷肥的利用率更高。CN 102391960 ACN 102391960 ACN 102391968 A
权 利 要 求 书
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1.一种根际促生菌（Arthrobacter chlorophenolicus L4），于2011年8月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为氯酚节杆菌（Arthrobacter chlorophenolicus），保藏号CGMCC No.5102。
2.根据权利要求1所述的一种根际促生菌，其特征在于：所述根际促生菌能高产吲哚乙酸并能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长。
3.如权利要求1所述的根际促生菌在花生栽培上的应用。
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说 明 书
一种根际促生菌及其应用
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种微生物，具体地说涉及一种根际促生菌及其应用。
背景技术
我国红壤面积约占全国土壤总面积的1/5，是我国热带、亚热带经济林果、经济作物和粮食生产的重要基地。红壤本身所具有的富铝化、酸化、铁质化及抗蚀性弱等物质循环特征与规律的影响，我国红壤地区当前生态与环境系统及土壤退化问题已极为严重，正因如此，红壤区土壤与环境问题已成为世界土壤和环境科学的研究热点。 [0003] 我国大多数耕地土壤全磷的80%以上为各种形态的无机磷酸盐，尤其由于红壤属酸性土壤，其中含有大量的铁、铝等金属离子，施入土壤中的水溶性磷肥很快被这些离子固定，丧失其有效性，从而降低了植物对肥料的利用率。 [0004] 在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）是重要的益生菌，是生活在土壤或定植于植物根表、根内或茎叶的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益微生物，通常指具有固氮、溶磷、产生植物激素、分泌抗生素和产生促进植物生长生理活性等能力。但现在大部分植物根际促生菌还为被驯化成可有效应用于促进植物生长并具有较好溶磷效果的菌种，未必适应红壤的土壤环境。
[0002]
发明内容
发明目的：本发明的一个目的是提供一种根际促生菌，可在红壤环境中有效促进
作物生长，同时可将难溶性磷酸盐转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐；本发明的另一个目的是提供一种根际促生菌在花生栽培上的应用。 [0006] 技术方案：为实现上述目的，本发明的一种根际促生菌（Arthrobacter chlorophenolicus L4），于2011年8月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所（邮编100101）分类名为氯酚节杆菌（Arthrobacter chlorophenolicus），保藏号CGMCC No.5102。
[0007] 所述根际促生菌菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，幼龄菌体为不规则杆状，常呈V形排列端圆，老细胞则缩短为球形，单个、成对排列，不规则的堆状排列，不产芽孢。
[0008] 所述根际促生菌的生理生化特性是：革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阴性。
[0009] 本发明所述的根际促生菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、
[0005]
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硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖；使用的无机组分包括包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的根际促生菌发酵可在28~32℃，pH5~9的环境下进行。
[0010] 所述根际促生菌能高产吲哚乙酸并能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长。 [0011] 本发明所述的根际促生菌分泌吲哚乙酸（IAA）的能力强，达152.19μg·mL-1。吲哚乙酸是植物激素的一种，能够促进根的发育。产吲哚乙酸的菌种，往往附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA3等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。表现为直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质的接触的机会；可提高植物体内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗逆性。作为本发明的优化方案，所述根际促生菌的发酵在pH5~6下进行，该环境下产IAA量最高。
[0012] 作为本发明的进一步优化，所述根际促生菌采用的碳源为木糖，采用的氮源为酵母粉或硝酸钾或两者的组合。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的根际促生菌产IAA的量最高。
[0013] 本发明所述的根际促生菌以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，所述根际促生菌对磷酸三钙的转化量达269.12 mg·L-1。相对于采用不接种菌作为空白对照的结果，所述根际促生菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出217.74 mg·L-1。本发明所述的根际促生菌还对磷酸铝和磷酸铁具有溶解作用，在实验摇瓶培养条件下分别比不接种菌作为空白的有效磷含量高出89.59 mg·L-1和115.32 mg·L-1。
[0014] 有益效果：本发明的一种根际促生菌高产吲哚乙酸，可有效将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，高产的吲哚乙酸促进花生的生长发育，土壤有效磷含量的提高也使得花生对磷肥的利用率更高。
附图说明
[0015] 图1是本发明菌株L4的菌落图；
图2表示不同初始pH对L4菌株产IAA的影响；图3表示不同装液量对菌株L4产IAA的影响；图4表示不同碳源对菌株L4产IAA的影响；图5表示不同氮源对L4菌株产IAA的影响；
图6表示种植花生30天后接种L4菌株对土壤IAA含量的影响；图7表示种植花生30天后接种L4菌株对花生根总长度的影响；图8表示种植花生30天后接种L4菌株对花生根表面积的影响；图9表示种植花生30天后接种L4菌株对花生根平均直径的影响；图10表示种植花生30天后接种L4菌株对花生根尖数的影响；图11表示种植花生30天后的土壤有效磷含量；
图12表示空白处理和接菌处理的花生根系生长情况对比，a图为对照不接菌处理组，b
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图为接L4菌株处理组。
具体实施方式
[0016] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。 [0017] 实施例1
好氧性试验
把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌， 穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。 30 ℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为严格好氧。
[0018] 过氧化氢酶的测定
在干净载玻片上滴1滴3%H2O2 ，取18~24 h的LB斜面培养物1环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果为接触酶阳性。[0019] 甲基红试验（M.R试验）
a. 培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节 pH7.0~7.2，分装试管，每管装 4~5 mL，121℃灭菌20 min。试剂：甲基红0.1g，95 %酒精300 mL，蒸馏水200 mL 。
[0020] b. 菌种培养及结果观察 接种菌株于上述培养液中，30℃培养 l~2 天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色~6.0黄色）。
[0021] 试验结果为M.R阴性。 [0022] 乙酞甲基甲醇试验（VP试验）
a. 培养基 培养基同甲基红试验。 b. 菌种培养及结果观察 接种与培养同甲基红试验。做 VP 试验时，取培养液（约 2mL）和等量的40 %NaOH 相混合，加少量肌酸，充分振荡2~5 min后，如培养液出现红色，即为VP 阳性。 [0023] 试验结果为VP阴性。 [0024] 淀粉水解试验
a. 培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3~5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。b. 菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。 [0026] 试验结果为淀粉水解阳性。 [0027] 明胶水解试验
a. 培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2~7.4，分装试管，培养基高度约为4~5cm，121℃灭菌20min。
[0028] b. 菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观
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察明胶是否液化。
[0029] 试验结果为明胶水解阳性。 [0030] 硝酸盐还原试验
a. 培养基及试剂蛋白胨10g，KNO31g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.4。格里斯氏（Gries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL；B液：蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%左右）150mL。二苯胺试剂:二苯胺0.5g溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。
[0031] b. 菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。
[0032] 试验结果为硝酸盐还原阳性。 [0033] 柠檬酸盐的利用
a. 培养基及试剂柠檬酸钠2g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2·HPO4 1g，1%澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。[0034] b. 菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30℃培养3-7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。 [0035] 柠檬酸盐利用的试验结果为阴性。 [0036] 实施例2
首先准备以下三种培养基。[0037] LB培养基：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，琼脂 20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌，20min。 [0038] LB 液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。 [0039] 无机磷细菌培养基（PKO培养基）：磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，pH 7.0琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。121℃灭菌，20min。 [0040] 无机盐培养基：硫酸铵2.0g；磷酸二氢钠0.5g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.2 g；二水氯化钙 0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌，20min。 [0041] 将从江西鹰潭采取的红壤土盛于盆钵中，然后将花生种子播于钵中（花生种子进行20%双氧水表面消毒20min，催芽2d），待花生生长30d后，轻轻拔出花生苗，抖落根上松散的附着土，将花生苗自根茎处剪断，称取根l0g置于盛有100 ml灭菌水的250 ml的三角瓶中，在摇床中，30℃，150r·min-1振荡20min，静置10min，得到根际土壤悬浮液。该根际土壤悬浮液中含有若干种根际促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30℃，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待用。
[0042] 下面再通过定性测定和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的根际细菌。 [0043] 定性测定：将分离纯化后的细菌接种于采用含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基，30℃，180 r·min-1摇床培养1d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液（50mL 35%HClO4+1mL 0.5M FeCl3）。将加入50μL 50 mg/L吲哚乙酸的
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比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30 min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。
[0044] 定量测定：对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液以10000 r·min-1离心10 min取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。
[0045] 把得到的产IAA菌进行溶磷情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有30mL无机磷细菌液体培养基的150 mL三角瓶，30℃，180 r·min-1培养4d后，将培养液装入离心管4℃下10000 r·min-1离心，15 min。取上清液用钼蓝比色法测定有效磷含量。 [0046] 通过以上测定即可筛选出高产吲哚乙酸，溶磷能力强的菌株，如图1所示。该菌株形成的菌落为较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，幼龄菌体为不规则杆状，常呈V形排列端圆，老细胞则缩短为球形，单个、成对排列，不规则的堆状排列，不产芽孢，株型命名为L4。
[0047] 将上述方法筛选分离出的菌株，经南京市金斯瑞生物科技有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与L4的序列用MEGA version 3 软件构建L4的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为氯酚节杆菌（Arthrobacter chlorophenolicus），同源性为100%。 [0048] 该菌种呈革兰氏阳性、无芽孢的不规则杆状。菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润。严格好氧，化能异养。最适生长温度为30℃。接触酶阳性，硝酸盐还原阳性。分泌IAA能力强，达到152.19μg·mL-1，以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。 [0049] 实施例3
为了进一步验证实施例1得到的根际促生菌L4产吲哚乙酸的能力和最适条件，下面针对不同pH、装液量、不同碳源、不同氮源探索对吲哚乙酸产量的影响。
[0050] 将含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培养基分别调节到不同的pH（4、5、6、7、8、9、10），取50mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的L4后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，结果如图2所示，表明pH为4和10时不产IAA，在强酸强碱环境中，菌体无法进行生长代谢，菌种在微酸环境中产IAA多于碱性环境，该菌种高产IAA的最适pH为5~6。 [0051] 将含有L-色氨酸(100mg/L)LB液体培养基按25ml，50ml，75ml，100ml，150ml装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的L4后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24 h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图3所示，由于菌株L4是好养代谢，通气量影响菌株产IAA的效率，50mL装液量时，菌株产IAA量最多，之后随着装液量增大，产量越少。
[0052] 在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基中分别加入1%（w/v）的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖等，取50ml装于250ml的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的L4 后，置于30℃，180 r·min-1摇床培养24 h ，按定量
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测定的方法测定产IAA的量。结果如图4所示，该菌株在供给木糖时，产IAA的能力最强，其次是麦芽糖，果糖的利用率最低，几乎不产IAA。
[0053] 在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基(不包括硫酸铵)中分别加入0.1%（w/v）的氮源，氮源包括硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、谷氨酸等，取50ml装于250ml的三角瓶中按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的L4后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24 h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图5所示，说明取酵母粉为氮源时，产IAA的量最多，除硝酸钾除外，有机氮源的利用率高于无机氮源。 [0054] 实施例4
本发明对花生具有明显促生长作用，下面通过盆栽试验进行说明。[0055] 采集自然条件下红壤0~20cm土层的新鲜土壤，过5mm筛，每盆装土700g，种植花生，调节含水量至田间最大持水量的60%，30天后采样，用根系扫描仪（LA1600+ scanner，Canada）扫描获得根系图像后，用根系分析软件（Winrhizo2003b，Canada）进行相关根系指标分析，用HPLC法测定土壤IAA含量，用钼蓝比色法测定土壤有效磷含量。 [0056] 花生种子：花生种子进行20%双氧水表面消毒20min，无菌水冲洗多次，催芽2d，选取发芽一致的种子备用。
接菌处理：将本发明的L4接种于LB液体培养基，30℃，180r·min-1摇床培养，培
养菌长至对数生长期，然后将菌悬液10000r·min-1离心10min，再用无菌水重悬同样离心三次，接种量为108CFU·g-1。 [0058] 对照处理：作为对照，土壤不喷洒L4菌液，加等量无菌水。 [0059] 结果如图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12所示。从图6可以看出，经接菌处理后，土壤IAA含量显著增加，比对照组高出2倍左右；从图7、图8、图9、图10可以看出，接种L4处理与不接菌处理进行对比，花生根系总长度，根平均直径，根表面积和根尖数都显著增加，促进了花生根系的发育；从图11可以看出，经接菌处理土壤有效磷含量提高了约90%。结合以上结果可以看出，本发明的根际促生菌L4对根基的生长、发育具有明显效果，IAA产量高，可以有效促进作物生长发育。
[0060] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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