维普资讯 http://www.cqvip.com 第３５卷 ２００７年１月 分析化学（ＦＥＮＸＩ ＨＵＡＸＵＥ） 研究报告 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第１期 ３１～３６ 磁性二氧化硅微球的表面修饰及其 在植物基因组核酸纯化中的应用 张志超 袁翠 万谦宏 （天津大学药物科学与技术学院，天津３０００７２） 摘要在利用自主研发的专利技术制备球形磁性硅胶微球的基础上，对磁性硅胶微球进行表面改性，使其 表面分别键合硅羟基、环氧基、邻二醇基和羧基等官能团，并对表面官能团进行了定量研究。以小牛胸腺基因 组脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）为模型化合物，研究了核酸在不同表面官能团的磁性硅胶上的吸附和脱附行为，发现 表面具有硅醇基的磁球对ＤＮＡ的回收率最高。将改性后磁性微球应用于玉米ＤＮＡ的提取，得到了平均长度 大于８ ｋｂ的高纯度基因组ＤＮＡ。与传统的有机溶剂抽提法相比，基于磁性微球的核酸固相萃取法具有快速 简便、省时省力、易于自动化的特点，适合于大规模植物基因组ＤＮＡ的样品制备。 关键词核酸纯化，磁性微球，表面修饰，固相萃取 １ 引 言 从生物样品中提取核酸是分子生物学和临床医学等生命科学研究领域中的一项基本技术。核酸提 取的传统方法如酚一氯仿抽提法，存在着有机溶剂毒性大、重复性劳动多、难以实现微型化、自动化操作 等缺点。而近年来发展起来的以玻璃粉…、离子交换树脂 、硅胶 等为吸附材料的核酸固相萃取法， 不仅可以避免使用毒性强的有机溶剂，而且能大幅度提高提取效率。基于固相萃取技术的核酸纯化微 芯片已经引起了人们的广泛关注＿４ｌ５］。磁性微粒作为一种新型的核酸固相萃取剂，借助于适当的磁分离 装置。可以进一步简化和加速核酸的分离与纯化过程，实现核酸纯化处理的微型化、自动化和平行化。。’ 。 最近，报道了新型磁性二氧化硅微球的合成及其在核酸纯化中的应用 。所合成的磁性微球具有 球形规整、粒度分布窄、磁响应性高的特点，尤其适合于在高粘度样品溶液中核酸的提取。由于磁性纳 米粒子均匀地分布在硅胶基质中，磁性硅球表面上存在大量的硅羟基和铁羟基等极性基团。这些极性 基团可能对核酸的吸附和洗脱产生影响。因此，需要考察核酸在具有不同极性官能团的磁性微球表面 的吸附和脱附行为。首先，用多种硅烷试剂对磁性硅球进行表面修饰，使其分别为硅羟基、环氧基、二醇 基和羧基等中性或弱酸性基团所包覆，然后以小牛胸腺ＤＮＡ为模型化合物，测定了核酸在经表面改性 的磁性微球上的回收率，并探讨了核酸在该磁性微球表面的结合机理。最后，以玉米面样品中基因组 ＤＮＡ的纯化为实例，对不同表面基团的磁性微球的提取效率（产率、纯度、完整性）进行了＇比较。 ２ 实验部分 ２．１仪器和试剂 １８０—８０型原子吸收光谱仪（日本日立公司）；ＵＶ－２４５０紫外扫描仪（日本岛津公司）；７５２型紫外一可 见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；磁分离架（美国Ｐｒｏｍｅｇａ生物技术公司）；ＤＹＹ－７型凝胶电 泳仪（北京市六一仪器厂）。 磁性硅胶微球Ａｆｉｆｍａｇ ＳＦ（平均粒径３．４ ｍ，比表面２４９．８５ ｍ ／ｇ，饱和磁化强度９．８ ｅｍｕ／ｇ）由天 津市倍思乐色谱技术开发中心提供。小牛胸腺购自天津市北辰区红光农场。玉米面购白天津大学附近 农贸市场。四乙氧基硅烷（ＴＥＯＳ）与环氧丙基丙氧基三甲氧基硅烷（ＫＨ５６０）均取自武大有机硅新材料 ２００６－０６－０７收稿；２００６－０９－０２接受 本文系国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．２０３７５０２７） Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｈｗａｎ＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｅｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com ３２ 分析化学 第３５卷 公司；亚氨基二乙酸（分析纯）购自中国医药集团化学试剂公司。ＰＥＧ。。。。和ＮａＣ１（分析纯，天津市光复精 细化工研究所）。琼脂糖（生物级）购白天津厚普生物试剂公司，１Ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（北京鼎国生物技术公 司）。其它试剂均为分析纯。 ２．２实验方法 ２．２．１标准小牛胸腺ＤＮＡ的制备用作标准参照物的小牛胸腺基因组ＤＮＡ按文献方法（浓盐法）制 备 ］。将制得的小牛胸腺ＤＮＡ溶于１０ ｍＬ １０％ＮａＣ１溶液中得到浓度为１．４６１ ｇ／Ｌ（经紫外光谱测定 ２６０ ｎｍ处吸收值后，通过Ｃ ＝５０Ａ ∞（Ｎ稀释倍数）得到的ＤＮＡ标准溶液备用。用紫外光谱测定ＤＮＡ 标准物的 胡 ２８ｎ为１．７９。 ２．２．２磁性二氧化硅微球的表面修饰 （１）磁性二氧化硅微球的硅羟基化将未修饰的磁性二氧化 硅微球（Ａｆｆｉｍａｇ ＳＦ，４．０ ｇ）加人体积比为５：１乙醇．水溶液（１９２．０ ｍＬ）中，分别加入浓氨水（４．０ ｍＬ）和 ＴＥＯＳ（１．２ ｍＬ），于室温下水浴摇床中振荡反应３ ｈ。产物经布氏漏斗减压抽滤后，用去离子水洗涤至中 性，以乙醇、丙酮洗涤并于真空６０℃下放置过夜（以下几种磁性微球的烘干条件与此相同），得到表面包 覆ＳｉＯ２的磁性微球，记为Ａｆｉｆｍａｇ ＳＬ；（２）磁性二氧化硅微球的环氧基化Ａｆｆｉｍａｇ ＳＬ磁球以ｐＨ值为１ 的稀盐酸溶液浸泡３０ ｍｉｎ后，重新以去离子水洗涤至中性，然后再用乙醇、丙酮各洗涤一遍。最后将所 得磁性微球烘干。将所得干燥磁性微球（３．０ ｇ）分散于无水甲苯（３０ ｍＬ）中，在氮气保护下加入环氧丙 基丙氧基硅烷试剂（ＫＨ５６０，１．５ ｍＬ），在１１０℃下回流反应８ ｈ。所得改性磁球依次用甲苯、甲醇、甲醇／ 水（１：１， ）和甲醇洗涤并抽干。烘干得到表面键合环氧基的磁性微球Ａｆｆｉｍａｇ．Ｅｐｏｘｉｄｅ；（３）磁性二氧 化硅微球的二醇基化将表面键合环氧基的磁性微球（Ａｆｆｉｍａｇ．Ｅｐｏｘｉｄｅ，１．０ ｇ）分散于ｐＨ值为３的稀 盐酸溶液（４０ ｍＬ）中，在１００￣Ｃ下加热回流２ ｈ。产物以去离子水洗涤至中性后，再分别以乙醇、丙酮洗 涤，过滤收集。烘干得到表面键合二醇基的磁性微球Ａｆｉｆｍａｇ—Ｄｉｏｌ；（４）磁性二氧化硅微球的羧基化将 １．６６ ｇ ＮａＯＨ溶于３０ ｍＬ去离子水中，随后于其中加入２．６６ ｇ亚氨基二乙酸。晃动烧杯使其溶解。所 得亚氨基二乙酸钠溶液在６０￣Ｃ下真空加热除去其中大部分水分。于剩余溶液中加人大量甲醇溶液，使 得亚氨基二乙酸钠盐析出。过滤收集。６０℃下真空烘干。 将表面键合环氧基的磁性微球（Ａｆｆｉｍａｇ－ＥＰＯＸＩＤＥ，１．０ ｇ）与亚氨基二乙酸钠（０．２ ｇ）先后加于甲醇 （２０ ｍＬ）中，搅拌下反应４８ ｈ。磁性微球产物以甲醇、水处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后，浸泡于 ｐＨ值为３的稀ＨＣ１中。３０ ｍｉｎ后，以去离子水洗涤产物至中性，再以甲醇、丙酮各洗涤一遍，过滤收集。 烘干得到表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微球Ａｆｆｉｍａｇ．Ｃａｒｂｏｘｙｌ。 ２．２．３表面修饰后磁性微球的表征 （１）表面修饰前后磁性微球中铁离子的溶出曲线 准确称取一 定质量的ＦｅＮＨ （ＳＯ ） ・１２Ｈ Ｏ，配制Ｆｅ¨浓度为１．０ ｇ／Ｌ的浓溶液。准确移取一定量该溶液，经稀释 得到浓度分别为０．０３８、０．１０１、０．１８９、０．３７７、０．５６６和０．７５５ ｍｇ／Ｌ的硫酸铁铵溶液，于波长４７９ ｎｍ下 测定其吸收值，得到Ｆｅ¨的浓度－吸收值曲线和线性回归方程。 分别称取０．１ ｇ磁性微球，分散于５０ ｍＬ ０．１ ｍｏｌｆＬ ＨＣ１中。分别在浸泡时间为７、ｌ５、３０、６０、１２０ ａｒｉｎ时取上层清液测其Ｆｅ¨吸收值作浓度．浸泡时间的铁溶出曲线；（２）Ａｆｆｉｍａｇ．Ｅｐｏｘｉｄｅ磁性微球表面 环氧基含量的测定磁球表面环氧基含量可以通过将环氧烷基团全部转化为邻二醇基，然后测定邻二 醇基含量来间接测定。以用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ！处理过的Ａｆｉｆｍａｇ ＳＬ磁性微球作为对照样品，以高碘酸氧化 反应测量Ａｆｆｉｍａｇ－Ｅｐｏｘｉｄｅ磁性微球表面环氧基含量。首先将Ａｆｆｉｍａｇ—Ｅｐｏｘｉｄｅ磁球于过量０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１溶液回流１ ｈ，将其表面的环氧烷基团全部转化为邻二醇基。表面邻二醇基含量的具体测定方法见 参考文献［１０］；（３）Ａｆｆｉｍａｇ—Ｃａｒｂｏｘｙｌ磁性微球表面羧基含量的测定磁性微球Ａｆｉｆｍａｇ．Ｃａｒｂｏｘｙｌ表面的 羧基含量以间接法测定。方法如下：准确称取０．１０７５ ｇ Ａｆｉｆｍａｇ—Ｃａｒｂｏｘｙｌ磁球，于１０ ｍＬ １０％ＣｕＳＯ 溶 液中浸泡１２ ｈ，之后于磁场下反复以去离子水洗涤５次。饱和吸附Ｃｕ 的磁球经一次无水乙醇洗涤 后，于真空９０ｃｃ下烘干１２ ｈ。烘干样品在６８＆Ｃ下马弗炉中煅烧３ ｈ，最后所得微球经硝酸酸化及过滤 处理后，所得清液在３２１．４ ｎｒｌｌ下通过原子吸收法测定Ｃｕ 的含量Ｃ ，羧基含量则为２ｃ 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期 张志超等：磁性二氧化硅微球的表面修饰及其在植物基因组核酸纯化中的应用 ３３ ２．２．４磁性微球悬液的制备取适量磁Ｉ生微球分散在去离子水中，制得浓度为ｌＯ Ｌ的磁性微球悬液。 ２．２．５改性磁性硅胶微球在核酸纯化中的应用 （１）小牛胸腺ＤＮＡ在磁性微球上的吸附和洗脱核 酸在磁性微球上的吸附和洗脱步骤的典型操作如下：首先，用精密移液器移取磁性微球悬液１ ｍＬ于 １．５ ｍＬ离心管中，在磁场下弃去上层清液。以ＰＢＳ溶液洗涤磁球一次并在磁场下将洗涤后ＰＢＳ溶液弃 去。向离心管中加入浓度为１．４６１ ｇ／Ｌ的ＤＮＡ标准溶液５０ Ｌ和由不同比例的聚乙二醇一８００ （ＰＥＧ。０００）组成的核酸吸附液１．０ ｍＬ，涡旋混匀。室温下温和振摇１０ ｍｉｎ。磁场下分离并弃去上层清 液，用８０％异丙醇１．０ ｍＬ，７０％乙醇１．０ ｍＬ先后洗涤磁性微球各两次。吹干乙醇。再向洗涤后的磁性 微球中加入ＴＥ缓冲液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，ＨＣ１，１ ｍｍｏＬ／Ｌ ＥＤＴＡ－２Ｎａ，ｐＨ ７．８）１．０ ｍＬ，涡旋混匀，静置等 待ＤＮＡ脱附１０ ｍｉｎ。磁场下分离磁性微球，吸取洗脱液用于核酸的紫外检测；（２）玉米基因组ＤＮＡ的 提取玉米基因组的提取方法参考文献［１２］。移取磁性微球悬液各１ ｍＬ于５个１．５ ｍＬ离心管中，磁 场下弃去上层清液。以ＰＢＳ溶液洗涤磁球一次后备用。取液氮下研磨过玉米面１．５ ｇ，加入到含有３．０ ｍＬ细胞裂解液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０，０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１）的７ ｍＬ离心管中。 加入１０％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）５００ Ｌ，６５ｃＣ水浴处理３０ ｍｉｎ，以４０００ ｒ／ｍｉｎ离心，得到１．５ ｍＬ细胞 裂解清液。移取０．３ ｍＬ上层清液于磁性微球中，涡旋５ ｓ。再加入核酸吸附液（２０％ＰＥＧ ，。。。－２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１）０．６ ｍＬ，涡旋混匀，室温下放置１０ ｍｉｎ。磁场下分离并弃去上层清液。取７０％乙醇１．０ ｍＬ洗涤 磁性微球各两次。吹干乙醇后，加入ＴＥ缓冲液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－２Ｎａ，ｐＨ ７．８） ２００ ，涡旋混匀。静置下等待ＤＮＡ脱附１０ ｍｉｎ。磁场下分离磁性微球，吸取洗脱液分别对其中的核 酸进行紫外检测和凝胶电泳分离。 ２．２．６纯化核酸的凝胶电泳检测将样品溶液（１０ Ｌ）与０．１倍体积的溴酚蓝水溶液和１／６样品溶液 体积（２ Ｌ）的ＴＡＥ缓冲液上样，在用０．００１％（ ）溴化乙啶染色的１％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压 ８Ｏ Ｖ。经凝胶电泳分离的核酸用紫外扫描进行检测。 ３结果与讨论 ３．１磁性二氧化硅微球的表面修饰与表征 在波长４７９ ｎｍ下测得Ｆｅ 浓度与吸收值的线性回归方程为Ｙ＝０．１６５２Ｘ十０．００２６。根据该直线 可算得磁性微球铁溶出离子浓度与吸收值之间的铁溶出曲线。未经修饰的磁性硅胶微球Ａｆｉｍａｇｆ ＳＦ的 铁溶出曲线见图１。由图１可知，Ａｆｉｆｍａｇ ＳＦ在用强酸浸泡的过程中，Ｆｅ¨浓度在２．０ ｍｇ／Ｌ以上，且随 时间不断增加。而用ＴＥＯＳ修饰过的磁性微球Ａｆｆｉｍａｇ ＳＬ，Ｆｅ¨浓度始终在０．５ ｍｇ／Ｌ以下，且只是在浸 泡时的前１５ ｍｉｎ Ｆｅ 浓度有所增加，之后随着浸泡时间增加Ｆｅ¨浓度几乎不变。这表明Ａｆｆｉｍａｇ ＳＦ磁 球的表面有一定量的铁氧化物颗粒，在强酸浸泡下铁氧化物成分不断被溶解Ｆｅ¨。而通过ＴＥＯＳ修饰 后，Ａｆｆｉｍａｇ ＳＦ磁球表面的铁氧化物成分大部分被保护，从而其在低ｐＨ值下的稳定性提高。而Ａｆｉｆｍａｇ— Ｅｐｏｘｉｄｅ、Ａｆｆｉｍａｇ－Ｄｉ０１和Ａｆｆｉｍａｇ－．Ｃａｒｂｏｘｙｌ ３种磁性微球在强酸浸泡下，其Ｆｅ¨溶出浓度近于０，说明这 ３种磁性微球表面的铁氧化物已经被完全包覆。 以Ｆｅ Ｏ 颗粒提取ＤＮＡ时发现，基因组ＤＮＡ在Ｆｅ ０ 颗粒表面有较强的保留，从而导致ＤＮＡ的回 收率降低…］。而硅胶是一种比较好的ＤＮＡ固相提取材料，在用于提取ＤＮＡ时可获得较高的回收率。 实验以ＴＥＯＳ对Ｆｅ Ｏ ．ＳｉＯ 磁性微球进行了表面修饰，目的使磁性微球表面硅醇基化。这不但可以避 免ＤＮＡ洗脱难的问题，同时还可提高磁性微球的ｐＨ值适用范围。根据Ｓｔｔｉｂｅｒ制备二氧化硅微球的原 理 ］，反应采用了碱催化ＴＥＯＳ水解的条件，反应生成的ＳｉＯ 纳米颗粒被固定在磁性微球表面。由于 Ａｆｉｆｍａｇ ＳＬ表面仍有少量酸可溶性铁氧化物，因此在使用Ａｆｆｉｍａｇ ＳＬ进行接下来的表面改性前，预先使 用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１对其进行浸泡处理。Ａｆｆｉｍａｇ．－Ｅｐｏｘｉｄｅ、Ａｆｉｆｍａｇ－－Ｄｉｏｌ和Ａｆｉｆｍａｇ－．Ｃａｒｂｏｘｙｌ ３种磁性微球 在酸性条件下的铁溶出曲线证明，经过浸泡后，磁球表面的酸溶性铁氧化物基本上已经不存在。 硅胶表面键和环氧烷基团的方法已经很成熟 。经测定，Ａｆｆｉｍａｇ—Ｅｐｏｘｉｄｅ中环氧烷基团的表面含 维普资讯 http://www.cqvip.com ３４ 分析化学 第３５卷 量为０．１８ ｍｍｏＬ／ｇ。环氧基是一种反应活性较高的基团，在 酸性或碱性条件下易水解，生成邻二醇基。因此，Ａｆｆｉｍａｇ— Ｄｉｏｌ的表面邻二醇基的含量可估算为０．１８ ｍｍｏｌ／ｇ。 Ａｆｆｉｍａｇ．Ｃａｒｂｏｘｙｌ表面带有羧基基团。由于该磁球表面 的羧基含量可能较低。直接采用滴定的方法测定不准确。 因此，将磁球表面的亚氨基二乙酸基团通过配位反应以 ｃｕ 饱和，然后测量表面ｃｕ“含量，从而可以得到表面的 羧基含量。经测定，原子吸收测试表明Ｃｕ¨含量为０．０４５ 图１ 表面修饰前后的磁性硅胶微球中铁离子 ｍｍｏｌ／ｇ，从而得表面羧基含量为０．０９ ｍｍｏｌ／ｇ。表面带有 的溶出曲线 羧基的磁性微球是一种在ＤＮＡ提取纯化过程中常用的固 相材料¨ 。利用性质较活泼的环氧烷基团与亚氨基二乙 酸钠中亚氨基之间的缩合反应，可以将二乙酸钠基团键合 到磁球表面上。之后，将键合有二乙酸钠基团的磁球于酸 性条件下浸泡，用Ｈ 将表面的Ｎａ 置换掉，可以得到表面 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｍａｇｎｅｔ— ｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｉｎ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ １．Ａｆｆｉｍａｇ ＳＦ；２．Ａｆｉｍａｇ ＳＬ；３．Ａｆｆｉｍａｇ－Ｅｐｏｘｉｆｄｅ； ４．Ａｆｔｉｍａｇ－Ｄｉｏｌ：５．Ａｆｔｉｍａｇ－Ｃａｒｂｏｘｙ１． 带有羧基的Ａｆｆｉｍａｇ—Ｃａｒｂｏｘｙｌ磁性微球。 由于空间位阻的缘故，键和基团的覆盖率一般都低于５０％，即有高于５０％的硅羟基未被反应掉。 因此，Ａｆｆｉｍａｇ—Ｅｐｏｘｉｄｅ、Ａｆｉｆｍａｇ Ｄｉｏｌ和Ａｆｆｉｍａｇ Ｃａｒｂｏｘｙｌ ３种磁性微球表面除了分别含有环氧烷、醇基或 者羧基外，还具有相当多的硅醇基。但是，由于键合基团的臂长大于硅羟基，因而在提取核酸中，能与核 酸分子相互接触的主要是这些键合基团。 ３．２核酸在磁性硅胶微球表面的吸附和洗脱 根据文献［１７］，固定核酸吸附液的组成（２０％ＰＥＧ ㈣．２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１）和洗脱时间（１０ ｍｉｎ），以小牛 胸腺ＤＮＡ作为测试样品来考察表面官能团对ＤＮＡ提取回收率和纯度的影响。结果见表１。 表１ ５种磁性微球提取小牛胸腺ＤＮＡ和玉米ＤＮＡ的回收率和Ａ２６ｏ／Ａ２ 。比值 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｙｉｅｌｄｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＡ）ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ａ：印／Ａ： 。的比值可以表示提取出ＤＮＡ的纯度，当Ａ 印／Ａ ∞的比值在１．７０—２．００之间时，表示提取出 的ＤＮＡ纯度较高。由表２可知，这几种磁性微球提取出的ＤＮＡ纯度都比较高，是比较良好的提取ＤＮＡ 同相材料。 在２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ波长下分别测定核酸吸附体系中的上层清液，其吸收值均小于０．０３。这表明。 在该吸附条件下（ＰＥＧ。。。。，２０％；ＮａＣ１，２ ｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ几乎被完全吸附到磁性固相表面。但是在用ＴＥ 溶液洗脱时发现，不同表面官能团的磁球，ＤＮＡ回收率差别较大。Ａｆｆｉｍａｇ ＳＬ具有较高的提取回收率 （＞９０％）。但是，对于另外３种磁性固相材料，即表面含铁羟基、环氧基、邻二醇基和羧基的磁球，其回 收率则较低，在６０％一８０％间。实验表明，表面官能团对于固相萃取法提取ＤＮＡ的产率有较大影响。 了解ＤＮＡ在固相材料上的吸附与解吸过程有助于理解产生这种差别的原因。在一定高分子量聚 乙二醇（ＰＥＧ）和ＮａＣ１浓度下，ＤＮＡ从水溶液中析出并吸附到固相表面是一个很复杂的过程。Ｍｅｌｚａｋ 等认为，ＤＮＡ的脱水作用是ＤＮＡ析出的主要动力 。ＰＥＧ和ＮａＣ１是导致ＤＮＡ脱水的主要原因。在 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 分析化学 第３５卷 ４ Ｗ０ｌｆｅ Ｋ Ａ，Ｂｒｅａｄｍｏｒｅ Ｍ Ｃ，Ｆｅｒｒａｎｅｅ Ｊ Ｐ，Ｐｏｗｅｒ Ｍ Ｅ，Ｃｏｎｒｏｙ Ｊ Ｆ，Ｎｏｒｒｉｓ Ｐ Ｍ，Ｌａｎｄｅｒｓ Ｊ Ｐ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３： ７２７～７３３ ｆｅ Ｋ Ａ。Ａｒｃｉｂａｌ Ｉ Ｇ，Ｌｅｕｎｇ Ｗ Ｋ，Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｄ，Ｇｉｏｒｄａｎｏ Ｂ Ｃ，Ｐｏｗｅｒ Ｍ Ｅ，Ｆｅｒｒａｎｃｅ Ｊ Ｐ，Ｆｅｌｄｍａｎ Ｓ ５ Ｂｒｅａｄｍｏｒｅ Ｍ Ｃ．ＷｏｌＨ．Ｎｏｒｒｉｓ Ｐ Ｍ．Ｌａｎｄｅｒｓ Ｊ Ｐ．Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５：１８８０—１８８６ Ｘｉｅ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｙｕ Ｂ Ｂ，Ｇａｏ Ｈ Ｆ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｆｅｉ Ｗ Ｙ． Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．，２００４，２８０：１６４ １６８ 誊ｐａｎ０ｖ直Ａ，Ｒｉｔｔｉｃｈ Ｂ。Ｂｅｎｅ￣Ｍ Ｊ，Ｈｏｒ￣ｋ Ｄ．＇，＿Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００５，１０８０：９３—９８ Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｌ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｃｈｅｎ Ｌ Ｇ，Ｗａｎ Ｑ Ｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ＪＰｒ０ｇ．，２００６，２２（２）：５１４—５１８ Ｇｕｏ Ｙｏｎｇ（郭勇）．Ｍｏｒｄｅｒｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（现代生化技术）．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ（广州）：Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ（华南理工大学出版社），１９９６：２２７～２２９ Ｓｕｎ Ｙｕｑｉｎｇ（孙毓庆）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（分析化学，上册）．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（第三版），Ｂｅｉｊｉｎｇ（北京）：Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ（人民卫生出版社），１９９６ ｔ ２０６—２０８ １１ １２ Ｔａｙｌｏｒ Ｊ Ｉ，Ｈｕｒｓｔ Ｃ Ｄ，Ｄａｖｉｅｓ Ｍ Ｊ，Ｓａｅｈｓｉｎｇｅｒ Ｎ，Ｂｒｕｃｅ Ｉ Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２０００，８９０：１５９—１６６ ＳｔＳｂｅｒ Ｗ，Ｆｉｎｋ Ａ．Ｂｏｈｎ Ｅ． ＣｏＵ．１ｎｔｅ￣Ｓｃｉ．，１９６８，２６：６２—６９ １３ Ｌｉｕ Ｇｕｏｑｕａｎ（刘国诠），Ｙｕ Ｚｈａｏｌｏｕ（余兆楼）．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＣｏｌｕｍｎ（色谱柱技术）．Ｂｅｉｊｉｎｇ（北京）： Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ（化学工业出版社），２ｏ０４：２０６～２０７ ￣ｐａｎｏｖ６ Ａ，Ｈｏｒ６ｋ Ｄ，Ｓｏｕｄｋｏｖ６ Ｅ，Ｒｉｔｔｉｃｈ Ｂ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００４，８００：２７—３２ １４ １５ Ｚｈａｎｇ Ｌｉｍｉｎｇ（张立明），Ｚｈａｎｇ Ｚｈｉｃｈａｏ（张志超），Ｗａｎ Ｑｉａｎｈｏｎｇ（万谦宏）．Ｃｈｉｎｅｓｅ＇，＿Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．（分析化学）， ２００６，３４（７）：９２３—９２６ １６ Ｍｅｌｚａｋ Ｋ Ａ，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｃ Ｓ，Ｔｕｒｎｅｒ Ｒ Ｆ Ｂ，Ｈａｙｎｅｓ Ｃ Ａ． Ｃｏｉｌ．１ｎｔｅ￣．Ｓｃｉ．，１９９６，１８１：６３５￣６４４ Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９９５，１０２：６５９５—６６ｏ２ １７ Ｈａｒｖｅｙ Ｓ Ｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８３，１１：４８６７—４８７７ ｅｖｓｋａｙａ Ｖ Ｖ，Ｋｈｏｋｈｌｏｖ Ａ Ｒ，Ｍａｔｓｕｚａｗａ Ｙ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｋ． １８ Ｖａｓｉｌ１９ Ｘｕ Ｈ，Ｙａｎ Ｆ。Ｍｏｎｓｏｎ Ｅ Ｅ，Ｋｏｐｅｌｍａｎ Ｒ． Ｂｉｏｒｎｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．．２００３，６６：８７０～８７９ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｉｌｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｚｈａｎｇ Ｚｈｉ－Ｃｈａｏ，Ｙｕａｎ Ｃｕｉ，Ｗａｎ Ｑｉａｎ－Ｈｏｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆ ｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｉｆｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７２） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｓ ｆｏｕｎｄ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏ— ｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ａ ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉ－ ｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｗｅｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｂｏｎｄｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｌａｎｏｌ，ｅｐｏｘｉｄｅ，ｄｉｏｌ ａｎｄ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｆｏｌ－ ｌｏｗｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅｄ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕ— ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＡ）ａｓ ｍｏｄｅｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ．Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ． ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｂｙ ｓｉｌａｎｏｌ ｇｒｏｕｐｓ ｇｏｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｙｉｅｌｄｓ．Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏ— ｓｐｈｅｒｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ＤＮＡ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈｓ ＞８ ｋｂ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ—ｌｉｑｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ—ｐｈａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｓｐｅｅｄ，ｔｉｍｅ－ｓａｖｉｎｇ，ａｎｄ ｂｅｉｎｇ ａｍｅｎａｂｌｅ ｔｏ ａｕｔｏｍａ－ ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ａｄａｐｔｅｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ （Ｒｅｅｅｉｖｅｄ ７ Ｊｕｎｅ ２００６；ａｃｃｅｐｔｅｄ ２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００６）
