甲基化的检测方法与临床应用

摘要】DNA甲基化是表观遗传修饰最基本的方式,在维持正常细胞功能、胚胎发育和肿瘤发生、动脉粥样硬化中起着重要的作用,是当前学术研究的重点和热点。随着研究的深入,各种各样的甲基化检测方法被开发出来同时在临床应用也初见端倪，甲基化的深入研究必将对人类健康产生深远的影响。

【关键词】表观遗传 DNA甲基化 PCR 检测 重亚硫酸盐 单亲遗传病 肿瘤 动脉粥样硬化 老化

DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰,是表观遗传学(epigenetics)的重要组成部分[1]。甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。它参与了动物胚胎发育、基因印迹、X染色体失活等过程,在基因表达的调控中具有重要作用。基因组正常甲基化模式改变与某些遗传病和肿瘤[2]以及动脉粥样硬化性[3]有着密切相关性。本文就目前常用的甲基化检测方法和临床应用予以综述。 1 基因甲基化的检测方法 1.1高效液相色谱柱

Kuo等首次报道高效液相色谱柱(HPLC),它能够定量测定基因组整体甲基化水平,其过程是: 用酸或酶将DNA裂解为五类单核苷酸(包括5-mC)。因五类核苷酸在极性溶液中的溶解度不同,在经过非极性的过滤柱时,出柱时间也不同,用波长260 nm的紫外光测定流出液的吸收峰并定量。此法灵敏度高，是目前测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法,但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯度要求较高。

1.2特异性位点的DNA甲基化的检测

1.2.1甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法

甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitiverestri ctionendonuclease MS-RE)-PCR/Southern方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性,将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常用的酶有HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)其中HpaⅡ和MspⅠ均能识别CCGG序列,然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时,HpaⅡ不切割,利用HpaⅡ-MspⅠ的这种属性处理DNA,随后进行Southern或PCR扩增分离产物,明确甲基化状态[4]。其优点是可同时检测基因组内多个CpG位点,实验结果易解释,成本低廉。缺点是:①由于CG不仅仅限于CCGG序列中,因此非该序列中的CG将被忽略;②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义;③需要样本量大;④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题;⑤不适用于混合样本。 1.2.2直接测序法

直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化的方法。过程是:重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,用不含任何CpG位点的引物行PCR扩增。扩增后尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,根据缺失条带判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵。 1.2.3甲基化特异性的PCR

Herman等[5]在重亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的

PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR),它将DNA先用重亚硫酸盐处理,随后行引物

特异性的PCR。用针对甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为甲基化;用针对非甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为非甲基化,由此明确待测序列中CpG位点是否存在甲基化。这种方法的优点是:①避免了使用限制性内切酶及相关问题;②敏感性高;可用于石蜡包埋样本[6]。缺点是:①引物设计要求高,可靠的MS-PCR引物需设计包含2个或多个完全甲基化或非甲基化CpG位点,由此限制了MS-PCR的使用;②这种方法只能作定性研究,不能作定量检测;③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。 1.2.4Methylight

Eads等[7]报道Methylight是一种基于Taqman探针的甲基化特异性定量PCR技术。与MS-PCR不同的是加入了Taqman探针,探针的5'端连接报告荧光, 3′端连接淬灭荧光。如果探针能够与DNA杂交,则在PCR用引物延伸至探针时,TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列5′端的报告荧光切下,3′端淬灭荧光不再抑制5'端报告荧光,报告荧光发光,测定报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平;高敏感、快速是本方法最显著的特点,此外该法具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点,可以为临床样本的研究提供可靠的技术支持。缺点是费用高,测定每个位点都要用一对引物和探针,受较多因素影响。 1.2.5 DNA微阵列法

Yan等[8]将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA甲基化检测中,具体方法是：首先对待研究片段用重亚硫酸盐处理，再行PCR扩增,其产物的3′端用荧光素标记然后与5′端固定于玻璃板上的GC的探针或AC的探针杂交、扫描。探针的荧光信号强度与M/M+U值(M表示甲基化,U表示非甲基化)存在线性关系[9]。该法可用于多样本、多位点甲基化的检测,样本需要量少,适于临床样本,但不能得到每个CpG位点的信息,且探针可能存在交叉杂交,致结果假阳性,影响分析。 1.2.6 MS-MLPA

MS-MLPA(methylation-specificmultiplex ligation-dependenprobe amplification)是Nygren等[10]在MLPA[11]基础上改进后提出的用于检测特异位点甲基化的方法。具体过程:应用MS-MLPA探针(探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点)和标本DNA进行杂交使之结合形成DNA-探针复合物，并用连接酶将探针连接，然后，加入甲基化敏感限制性内切酶（如HhaⅠ），若含有的位点存在甲基化,则HhaⅠ不切割,探针顺利连接,随后的PCR照常进行反之则不能，最后根据扩增片段明确定靶基因的甲基化情况。这种方法的优点是:①需要样本的数量少,由于探针具有非常短的识别序列,因此MPLA可以用于局部降解的DNA,如石蜡包埋的DNA样本;②可用于分析大量混合样本,可一次检测多个靶基因中CpG位点的甲基化情况。缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制,且要考虑到所用酶的反应适宜温度。 2 DNA甲基化与临床应用

2.1单亲遗传病 单亲遗传病是指由非孟德尔遗传方式引起的人类的遗传病。该病的发生与双亲遗传的等位基因发生差异甲基化区域有关，正常情况下是不发病的，但是等位基因中非甲基化一方这段本来应有活性的基因片段出现异常或未能完整地遗传给子代,则会引起一系列人类疾病。主要有:贝克威思-威德曼综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome,BWS),普拉德威利综合征(Prader-WilliSyndrome, PWS),安格曼综合征(Angelman syndrome,AS)和特纳综合征(TURNER,TS)等。

2.2肿瘤 肿瘤的早期诊断，治疗以及预后评价一直是医学的关注焦点。肿瘤细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞,但某些特定基因(如肿瘤抑制基因)CpG岛却处于高甲基化状态[12]。由于细胞转化过程中的甲基化现象早于明显的恶性表

型出现,甲基化研究可以为肿瘤的早期诊断提供生物学标记，同时DNA甲基化是一种不改变DNA一级结构可逆的表观遗传修饰,纠正异常的甲基化状态成为治疗肿瘤的一种新策略。甲基化改变与传统的预后指标之间也存在密切联系[13]。 2.3动脉粥样硬化 智艳芳等[14]首次报道动脉粥样硬化（AS）病人低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因启动子区出现显著增高的甲基化修饰度。AS患者雌激素受体-α（ER-α）基因启动子区CpG岛出现高度甲基化，且甲基化程度与血同型半胱氨酸（tHcy）浓度呈正相关。高Hcy血症很可能通过干扰ER-α基因的甲基化而促进AS的发生、发展。这为心脑血管病的发病机理提供了进一步的理论支持。 2.4老化 随着年龄的老化,基因组总体DNA甲基化水平逐渐降低。这一甲基化水平的变化,是否仅与老化有关,还是也参与老化过程中的肿瘤高发,尚有待进一步研究。 3 结语

DNA甲基化的研究有许多方法,在选择时首先需要考虑的是待测对象是特定基因还是基因组。由于各种方法各有其优缺点,准确的基础研究和临床筛查对所需方法的要求亦不一样。本文所介绍的方法,希望对于DNA甲基化的研究有所帮助。同时疾病的去甲基化实验性治疗已经在有条不紊地进行，相信在不久的将来在人们完全认识其安全性的基础上，基因甲基化对疾病的预测、检测、治疗和预后判断开辟另一条广阔的天地。

参 考 文 献

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