从HPLC到UPLC的方法转换以适应更高的分析通量

从HPLC到UPLC的⽅法转换以适应更⾼的分析通量⼀个典型的HPLC分析⽅法成功地转换并优化为Waters

ACQUITY UPLC TM⽅法，既达到了样品分析的⾼通量⼜得到更⾼的分析灵敏度。提出了进⼀步快速转换⽅法的策略。对运⾏成本和样品通量的分析表明：UPLC的成本优势要超过HPLC。

⽇益增长的制药⾏业⼤批量样品分析的需求，促进了ACQUITY Ultra Performance LC (UPLC TM)的研制和开发。这个系统之所以能够提供如此快速的分析，得益于它采⽤了⼩颗粒杂化填料(1.7µm)，它具有极好的分离度和奇特的化学特性。(1-5)为了与这种⼩颗粒杂化填料相匹配，实现快速分析，Waters公司在普通液相⾊谱的基础上，从⾊谱柱到⾊谱系统都进⾏了⼤幅度改进。要实现真正的超⾼效液相⾊谱分离，UPLC仪器系统必须耐⾼压（⾼达15000psi）、死体积⼩，且检测器的数据采集速率要⼤⼤提⾼以与⾼速流出的⾊谱峰匹配。新型的针内针设计真正地防⽌了交叉污染，极⼤地提⾼了检测灵敏度。在本⽂中，⼀个⽤于质量控制（QC）的HPLC⽅法被优化为UPLC⽅法，⽬的是减少总运⾏时间，降低分析成本和增加仪器正常运⾏时间。⽅法的开发

初始的HPLC⽅法为：分析时间：10分钟，样品：溶于有机溶液中的杂环药物（Cpd A）。加⼊内标以补偿样品前处理所造成的损失，采⽤梯度是必要的，⽬的是清洗后⾯流出的⼲扰物。

从普通HPLC⽅法转换为UPLC⽅法，开始仅仅是将流动相流速、进样体积进⾏简单的换算。换算因⼦由⾊谱柱横截⾯积的⽐率得到，以保持相同的线速度。

从UPLC得到的⾊谱峰是⾮常窄的，超凡的分离度表明⽅法尚有改进的余地。原来认为：只要柱反压允许，流动相的流速可以随意提⾼。但是后来对⾊谱柱寿命的研究表明，⽤提⾼流动相中的有机相含量的⽅法来缩短分析时间似乎更经济合算，溶剂的消耗也⼤⼤减少。

图（1）显⽰的是由最初HPLC ⽅法通过简单的按⽐例缩⼩得到的UPLC⾊谱图。最下⾯的是经过优化的UPLC⾊谱图。表?Ⅰ列出了HPLC及UPLC⽅法具体的⾊谱条件及药物分析结果。⽅法优化指南及探讨

在优化UPLC⽅法时除要考虑⽅法转换的速度外，还应考虑以下⼏点：●利⽤UPLC⾼分离度的优势，增加流动相的强度，可以缩短分析时间。（见表Ⅱ）

●对延长⾊谱柱寿命来说提⾼流动相的流速不如增加溶剂强度。虽然，UPLC可以做到在⾼流动相线速度下仍保持良好的分离度。然⽽，对于任何柱⼦，经常在80%最⼤流速压⼒下运⾏都会减少⾊谱柱的寿命。（见图2）。依据我们的经验，与HPLC相⽐，UPLC在反压达到8000psi时柱损耗还是⽐较低的。尽管与

传统的HPLC相⽐，UPLC的损耗已经很⼩（⽐HPLC降低了⼀个数量级），但是若尽可能地保持低流速，还可以进⼀步减少溶剂的损耗和废液的处理费⽤。

● 由于UPLC 的系统体积很⼩，可以减少⾊谱柱的再平衡时间。流动相的变化需要⼀定的时间才能到达⾊谱柱。UPLC 极低的系统体积（110µL ，仅为HPLC 的15%)允许进⼀步缩短分析时间。在UPLC 上，当下⼀个样品进样时，⾊谱柱已达到了再平衡。它使得分析通量进⼀步提⾼。

● 根据⾊谱柱的内径，适当地减

⼩进样体积，可以得到更好的峰形。当过量的强溶样溶剂加到⾊谱柱头时，⾊谱峰会分叉。UPLC ⼀般最⼤允许进样体积为5µL ，依据我们的经验，⼀般采⽤1-3µL 。值得⼀提的是：由于UPLC ⾊谱柱的分离度⾼、

进样器的交叉污染很低，这么⼩的进样量也会得到理想的峰⾼、达到相当或更低的LOQ （测试结果表明：UPLC 的交叉污染仅为HPLC 的10%）。另外，⼩体积进样还可以降低样品溶剂的强度，使得样品在柱头集中进样。● 尽量先试⽤部分定量环进样⽅

式，如图（3）所⽰：即使当进样体积达到定量环的80%时，部分定量环进样都能得到很好的精密度。在传统的HPLC 检测中，⼀般进样量的体积都是控制在定量环体积的50%左右。UPLC 的进样系统⽤两段⽓隙将样品夹在中间，能更好地利⽤定量环且精密度更好。这种进样⽅式⽐满定量环进样⽅式更节省样品。从实验的⾓度来看,满定量环进样需要⾜够多的样品才能实现充满定量环的功能。这样可能要增加随后的洗针，将会影响样品通量和加⼤洗针硬件的磨损。⼤体积的样品转换也增加了样品颗粒析出的可能性，影响仪器的长期可靠性。

图1 ：从上往下：原来的HPLC ⾊谱图；通过简单的缩放得到的UPLC ⾊谱图（峰形变窄）；优化过的UPLC ⾊谱图。峰1:内标；峰2：CpdA

● 如果想采⽤满定量环进样⽅式(也

许是为了满⾜⾮常⾼的精密度的要求)，则要保证样品在定量环内充分溢出。在很窄的UPLC 进样管线内，样品在管壁边的流速和在管中⼼的流速是不同的。采⽤满定量环进样，⾄少要⽤四倍定量环体积的样品溢流定量环，以确保样品将洗针液从5µL定量环中置换掉。UPLC 仪器在出⼚时对每⼀种规格的定量环都⽤典型的样品溶剂测试并设置了优化的溢流体积作为缺省值。对于某些特别的样品成分，分析者也可以另外设置相应的溢流体积。● 选择合适的弱洗针液和弱洗针液的

⽤量，可以得到更窄的⾊谱峰形。在采⽤部分充满定量环进样⽅式时，会有部分弱洗针液与样品相伴进⼊⾊谱柱。因此，弱洗针液的组成要与流动相初始组成条件⼀致。利⽤弱洗针液作为定量环内样品的稀释液能够使样品在⾊谱柱头上富集，防⽌样品扩散。设置弱洗针液体积时要注意，所⽤弱洗针液的体积要⾜够⼤，要能将前⾯所⽤的强洗针液充分替换出去。

图2：由UPLC 实验数据得到的van Deemter 曲线表明，⽤提⾼流速来减少总运⾏时间是⼀个似是⽽⾮的策略。这要权衡反压对⾊谱柱寿命的影响（见正⽂）

图3：利⽤UPLC 标称5µL (实际4.8µL)的定量环，以部分充满环进样⽅式，得到的峰⾯积与进样体积的关系图。 对于⼀般的部分充满定量环进样，线性范围仅为进样环的40-50%。

初步的⽅法验证

初步的评估包括对分析⽅法和仪器进⾏线性范围、精密度、准确度、系统适⽤性，和样品的交叉污染的考察。线性和最低定量限（LLOQ ）

UPLC 的灵敏度很⾼，定量范围很⼴（1—500倍）。⽤同⼀个UPLC 分析⽅法校正，可以得到两个不同范围的线性标准曲线。（见图4和5）。具有54ng/mL 定量限（LLOQ ）的UPLC 低范围的分析⽅法可⽤于更有特⾊的LC/MS 分析。特别要指出，这台UPLC 配置的是PDA 检测器。如果⽤单波长检测器可以得到更低的定量限。精密度和准确度

在每个指定浓度下，进样三次，以测定其精密度（重复性）和准确度。利⽤峰⾯积的相对标准偏差来衡量仪器的精密度

（RSD ）。准确度是利⽤峰⾯积的标准曲线来计算每⼀个样品的含量，再与理论值相⽐，以百分⽐的形式给出。结果⾼、低两种浓度的精密度、准确度均符合要求。（见表Ⅲ和Ⅳ）

图4：低浓度（0.054-1.30µg/mL ）时浓度和峰⾯积之间的线性关系。（R 2=0.996 ；1/X 2权重）

图5：⾼浓度（0.325—25.8µg/ml）时浓度和峰⾯积之间的线性关系。（R2=0.999967 ;1/X2权重）

系统适⽤性

同⼀样品连进五针，⽤以考察系统的适⽤性。结果均达到USP要求。（见表Ⅴ）两次进样之间的交叉污染

上⼀样品的残留会对下⼀针样品产⽣污染(交叉污染)，它将直接影响⽅法的LLOQ。交叉污染还会导致仪器精密度、准确度和系统适⽤性检测的失败。然⽽，从详细的研究来看，没有显⽰出明显的交叉污染的影响。此处将浓样和稀释样品混合编组直接测量交叉污染,期望会出现因交叉污染导致的结果不准确。

UPLC采⽤了神奇的针内针设计，两套独⽴的进样器清洗系统，极⼤地减少了交叉污染的机会。在本实验中，我们采⽤了

200µL的甲醇作为强洗针液，⽤以除去⼤部分有机残留物。接下来再⽤600µL的⽔：⼄腈（90：10）置换强洗针液，使得定量环、进样针、阀内充满了与⽅法的初始条件⼀致的溶剂。

交叉污染的测定可以通过在检测完标准样品后，检测其溶剂空⽩值得到。本实验中，在检测5次低浓度标准样品后检测的空⽩值为未

检出。检测完最⾼浓度标样后检测空⽩，发现有些微⼩的相关峰，其⾯积是上⼀针标样的0.01%,这是可以接受的。然⽽，还可以通过优化清洗液的设定来进⼀步消除交叉污染。作为对照，HPLC的交叉污染⽐UPLC⾼出5-10倍。结论

本实验将有机溶剂萃取液中的杂环药物的QC HPLC定量⽅法成功地转换并优化为UPLC⽅法。初步实验表明该⽅法可以被验证。总结了如何加速开发UPLC⽅法的指南。UPLC的应⽤具有成本优势。对于每⼀个分析任务来说，UPLC的⾊谱柱消耗与HPLC相当甚⾄更

低⼀些，其溶剂的损耗、废液的处置费⽤⽐传统的HPLC要⼩⼀个数量级。ACQUITY UPLC TM的分析时间减少了5倍，令⼈瞩⽬地提⾼了仪器的投资回报率并降低了对仪器(假如只配置HPLC)总台数的需求。