尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110194790 A(43)申请公布日 2019.09.03

(21)申请号 2019104474.1(22)申请日 2019.05.27

(71)申请人 南京农业大学

地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇

国家农业科技园南京农业大学基地(72)发明人 王源超　杨波　王雨音　柳泽汉　

郑文跃　(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任

公司 32218

代理人 李晓峰(51)Int.Cl.

C07K 14/37(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)

()发明名称

尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其应用(57)摘要

本发明公开了一种尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其应用，该蛋白能够诱导植物抗性，可以作为一种植物免疫激活因子应用到植物病害的防治领域。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用工程菌株表达可以获得高浓度的蛋白，可以用于提高烟草和大豆的抗病性，所涉及的植物病害为烟草花叶病和大豆根腐病。该植物免疫激活蛋白不仅能够显著提高植物抗病性，而且所需浓度低、见效快，作用时间长。FoPII1为提高植物抗病性、防治植物病害提供了新的途径。CN 110194790 AA01H 5/00(2018.01)A01H 6/(2018.01)A01H 6/82(2018.01)C12R 1/19(2006.01)

权利要求书1页 说明书9页序列表5页 附图4页

CN 110194790 A

权　利　要　求　书

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1.一种尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，该基因为如下(1)或(2)：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ ID NO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为在pGEX-4T-2中插入FoPII1编码基因得到的原核表达载体。

6.权利要求1所述的植物免疫激活蛋白FoPII1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或大豆。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗病性为对烟草花叶病或大豆根腐病的抗性。

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尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其应用

技术领域

[0001]本发明设计生物技术领域，具体地，涉及一种尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白及其应用。

背景技术

[0002]尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起豆科、茄科、瓜类、香蕉、棉花、及花卉等100多种植物枯萎病的发生，给农业生产造成巨大损失(Gordon and Martyn,1997)。由于生产上缺乏针对尖孢镰刀菌的抗病品种，因此该病原菌引起的病害防控困难，主要依靠化学防治。由于化学杀菌剂的使用量大，加之施药方法不够科学，带来了生产成本增加、农药残留超标、作物药害、病原菌抗药性、环境污染等一系列问题，严重制约了农业的可持续发展、危及人类健康。[0003]在使用化学杀菌剂防控植物病害的过程中，人们往往忽视了寄主植物本身对病菌的抵抗能力。植物在漫长的进化中已经逐步形成完备的免疫系统(Jones and Dangl,2006)。近年来，随着学科的发展以及技术的进步，科学家逐渐解析了植物免疫的相关机制，应用植物免疫的原理防治农作物的病虫害已经成为植物保护领域的重要发展方向。在病原菌侵染植物过程中，植物会利用细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)识别病原菌分泌的毒性因子，触发植物的基础免疫反应。这些能够激活植物免疫的因子通常被称为植物免疫激发子(Plant Immunity Inducer，PII)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。目前，鉴定病原菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白是国内外研究人员关注的焦点。

[0004]大量文献表明，尖孢镰刀菌在侵染植物早期，能够诱导植物免疫反应(Rep et al.,2004； Houterman et al.,2008；Shcherbakova et al.,2016；Thynne et al.,2017)。因此，鉴定尖孢镰刀菌分泌的新型植物免疫激活蛋白，不仅能够揭示尖孢镰刀菌与植物互作机理，而且能为开发激活植物免疫的蛋白质生物农药提供有效的蛋白资源。[0005]参考文献

[0006]Gordon TR and Martyn RD.The evolutionary biology of Fusarium oxysporium.Annu.Rev. Phytopathol.,1997,35,111-128.

[0007]Houterman PM,Cornelissen BJC and Rep M.Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector.Plos Pathogens,2008,4(5):e1000061.[0008]Jones JD and Dangl JL.The plant immune system.Nature,2006,444(7117):323-329.[0009]Rep M,Van Der Does H C,Meijer M,et al.A small,cysteine-rich protein secreted by Fusarium oxysporum during colonization of xylem vessels is required for I-3-mediated resistance in tomato. MolecμLar Microbiology,2004,53(5):1373-1383.

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Shcherbakova LA,Odintsova TI,Stakheev AA,et al.Identification of a 

novel small cysteine-rich protein in the fraction from the biocontrol Fusarium oxysporum strain CS-20 that mitigates Fusarium wilt symptoms and triggers defense responses in tomato.Frontiers in Plant Science,2016, 6.[0011]Thynne E,Saur IML,Simbaqueba J,et al.Fungal phytopathogens encode functional homologues of plant rapid alkalinization factor(RALF)peptides.Molecular Plant Pathology,2017,18(6):811-824.发明内容

[0012]本发明的目的之一在于提供一种尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1。[0013]本发明的目的之二在于提供一种编码上述尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1 的基因序列。

[0014]本发明的目的之三在于提供一种含有上述植物免疫激活蛋白FoPII1编码基因的重组表达载体。

[0015]本发明的目的之四在于提供上述尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其编码基因的应用。

[0016]本发明的目的可以采用以下技术方案实现：

[0017]本发明提供一种尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0018]本发明提供上述植物免疫激活蛋白FoPII1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。优选的，所述植物为烟草和大豆。当用于诱导植物抗性，减轻烟草花叶病和大豆根腐病危害时，所述FoPII1的浓度为1nM。

[0019]本发明提供上述尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1的编码基因。[0020]作为一种优选技术方案，所述的编码基因为如下(1)或(2)：[0021](1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；[0022](2)与SEQ ID NO.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ ID NO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有 85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。[0023]本发明还提供一种包含上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。优选的，所述的重组载体为在pGEX-4T-2中插入FoPII1编码基因得到的原核表达载体。该重组载体可用于大肠杆菌Rossetta(DE3)表达。得到分子量约KD的融合表达蛋白(GST- FoPII1)，能够诱导烟草、大豆等植物产生抗性反应，提高植物免疫力。减轻烟草花叶病毒对烟草的危害，降低尖孢镰刀菌和大豆疫霉菌引起的大豆根腐病的危害。

[0024]上述的植物免疫激活蛋白FoPII1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。优选的，所述植物为烟草或大豆。进一步优选的，所述的抗病性为对烟草花叶病或大豆根腐病的抗性。[0025]利用本发明的FoPII1氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在大肠杆菌中表达的核酸序列。

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本发明所述的植物免疫激活蛋白，可以是通过基因工程技术原核表达得到的蛋

白，也可以是利用尖孢镰刀菌培养液纯化得到的蛋白质。具有相同的效果。[0027]本发明的有益效果为：

[0028]该植物免疫激活蛋白可显著提高植物的抗病性，使用浓度低，见效快，作用时间长。 FoPII1利用植物自身的免疫系统，为提高植物抗性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

[0029]图1为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达植物免疫激活蛋白FoPII1后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

[0030]图2为检测证实FoPII1正常表达的SDS-PAGE检测图，所用抗体为anti-HA；[0031]图3为破碎后蛋白上清溶液中植物免疫激活蛋白FoPII1的SDS-PAGE检测图，所用抗体为 anti-GST；

[0032]图4为纯化后植物免疫激活蛋白FoPII1的SDS-PAGE检测图，所用抗体为anti-GST；[0033]图5为1μM植物免疫激活蛋白FoPII1处理烟草叶片过敏反应检测；[0034]图6为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导抗病相关基因的表达；[0035]图7为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导烟草抗花叶病毒的效果图；[0036]图8为花叶病毒侵染点数统计图；

[0037]图9为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导大豆抗大豆疫霉菌的效果图；

[0038]图10为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导大豆抗大豆疫霉菌的生物量统计图；[0039]图11为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导大豆抗尖孢镰刀菌的效果图；

[0040]图12为植物免疫激活蛋白FoPII1诱导大豆抗尖孢镰刀菌的生物量统计图；具体实施方式

[0041]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

[0042]微生物来源信息:所用尖孢镰刀菌菌株(Fusarium oxysporum f.sp.glycines)购自于美国典型菌种保藏中心ATCC(American Type Culture Collection，www.atcc.org)，菌株编号为

[0043]

18774TM。

实施例1.植物免疫激活蛋白FoPII1的分离与鉴定[0044]将尖孢镰刀菌接种于PDA(取去皮马铃薯200g，切成小块，加超纯水煮沸30min，用四层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，将滤液用超纯水补足至1000Ml，溶化后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min)平板，25℃培养7天，挑取菌落边缘处接种于200mL盛有PDB(配方同PDA培养基，琼脂粉不加)液体培养基的500mL三角瓶中，25℃、180r/min摇床培养5天，得到尖孢镰刀菌的培养液。取培养滤液在4℃、 8000rpm条件下离心30min，收集上清液，用0.22μM的滤膜(Whatman)进一步过滤除杂质。收集50mL所得培养液送至深圳华大基因公司进行蛋白质组学分析。基于尖孢镰刀菌基因组已经测序完成，蛋白质

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组学所得数据比对尖孢镰刀菌蛋白质数据库，确定了培养滤液中的5个尖孢镰刀菌分泌的候选蛋白。

[0045]实施例2.植物免疫激活蛋白FoPII1编码基因的克隆与植物瞬时表达[0046](1)总RNA提取：

[0047]以液体培养的尖孢镰刀菌菌丝为材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。[0048](2)反转录生成第一链：[0049]取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行 cDNA合成，定容至20μL反应。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。[0050](3)以cDNA第一链为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增FoPII1编码基因的全长：[0051]PCR引物扩增序列：[0052]上游引物：SEQ ID NO.3[0053](5’-CAGCTAGCATCGATTCCCATGAAGTTCTTCGCTGCTTTC-3’)[00]下游引物：SEQ ID NO.4[0055](5’-AATCTCTAGAGGATCCCCGTTGACAGAGAGGCTGTAGG-3’)，[0056]50μL反应体系为，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,Takara PrimerSTARTaq酶 0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15 秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收FoPII1编码基因的PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的FoPII1编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到 SmaI酶切的pGR107::3HA载体(载体购自于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心) 上得到pGR107::FoPII1-3HA质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳 50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取三个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作 (Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序所得序列应与SEQ ID NO.1序列一致。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL) 平板，28℃培养48h后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。[0057](4)农杆菌培养：

[0058]分别从平板上挑取转染pGR107::FoPII1-3HA载体及pGR107::GFP-3HA载体的农杆菌 GV3101单菌落，分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平 50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101 农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanes μL fonic acid,10mM MgCl2,200μM乙酰丁香酮pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌体，最终浓度各为OD600＝0.3。[0059](5)烟草叶片上瞬时表达FoPII1编码基因

[0060]将配好的农杆菌用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21- 23℃、14h光照/10h黑暗)培养。[0061](6)FoPII1蛋白累计量检测

[0062]收集注射两天后的烟草叶片进行蛋白累计量的检测。将收集的烟草叶片液氮速冻

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后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,1.0％(v/v)NP-40,1.0％(v/v) protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30min。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5 倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴5min。取10μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5h。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％(g/100ml)PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的HA一抗(Abmart)孵育2h后用PBST洗膜5min三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30min后用PBST洗膜 5min三次，扫膜拍照。[0063]结果：烟草叶片上瞬时表达FoPII1三天后，烟草叶片出现了明显的过敏性坏死反应 (如图1)。Western检测证实FoPII1能够正常表达(如图2)。[00]实施例3.植物免疫激活蛋白FoPII1的原核表达和纯化[0065](1)原核表达载体的构建

[0066]设计植物免疫激活蛋白FoPII1编码基因的特异性引物，[0067]上游引物：SEQ ID NO.5[0068](5’-TCCCCAGGA ATTCCC ATGTCGCCCACCACTCCCTCCAAGA -3’)[0069]下游引物：SEQ ID NO.6[0070](5’-CGCTCGAGTCGACCC GTTGACAGACAGACTGTAGGC-3’)，[0071]50μL反应体系为，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,Takara PrimerSTARTaq酶 0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15 秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收FoPII1编码基因的PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的FoPII1编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到 SmaI酶切的pGEX-4T-2载体上得到pGEX-4T-2-FoPII1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞 JM109，涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取三个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如SEQ ID NO.1。测序正确的质粒热激转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取阳性克隆用于后续实验。[0072](2)蛋白诱导表达

[0073]将验证正确的表达菌株过夜活化，同时取含有pGEX-4T-2空质粒的菌株作为对照。分别取1mL过夜培养液加入到含有50μg/mL氨苄的100mL LB液体培养基中(2％接种量)， 37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD600为0.6～0.8。加入诱导剂IPTG(终浓度为 1mM)，20℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。经高压破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到表达蛋白液。取20μL上清液，加入5μL的5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰染色。[0074]结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约kD的包含GST的融合表达蛋白 (GST-FoPII1)如图3。[0075](3)原核表达蛋白的纯化[0076]使用AKTA Explorer 100蛋白纯化仪进行原核表达蛋白的纯化。选用GST标签蛋白

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纯化柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和层析柱；取步骤(2)中得到的蛋白溶液进样，流速为1mL/min，至基线平稳后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰的组分进行脱盐处理，随后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。[0077]结果：获得纯化后的大小约为KD的原核表达蛋白(GST-FoPII1)如图4。[0078]实施例4.植物免疫激活蛋白FoPII1在烟草上引起的防卫反应[0079](1)原核表达植物免疫激活蛋白GST-FoPII1在烟草上引起的过敏性反应[0080]将纯化后的蛋白进行浓度测定，并稀释至1μM。利用注射器将稀释后的蛋白溶液注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)培养。[0081]结果：在1μM植物免疫激活蛋白FoPII1处理的叶片部位有明显的过敏性坏死反应出现 (如图5)。[0082](2)FoPII1诱导抗性相关基因转录水平显著升高[0083]经测定浓度后的FoPII1蛋白，将其浓度调整到1μM。选取生长旺盛的5～6期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将FoPII1蛋白从叶片背面注入不同的叶片中。同时以相同浓度的pGEX-4T-2(表达空载体蛋白)作为对照，注射6h后，收集样品，进行抗性相关基因转录水平的检测。提总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

[0084]反转录生成第一链:取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。反转录产物用水进行10倍稀释用于实时定量PCR反应检测基因沉默效率。

[0085]实时荧光定量PCR反应所用引物如下：[0086]NbCYP71D20上游引物：SEQ ID NO.7[0087]5’-CCGCACCATGTCCTTAGAG-3’[0088]NbCYP71D20下游引物：SEQ ID NO.8[00]5’-CTTGCCCCTTGAGTACTTGC-3’[0090]NbAcre31上游引物：SEQ ID NO.9[0091]5’-AATTCGGCCATCGTGATCTTGGTC-3’[0092]NbAcre31下游引物：SEQ ID NO.10[0093]5’-GAGAAACTGGGATTGCCTGAAGGA-3’[0094]NbWRKY7上游引物：SEQ ID NO.11[0095]5’-CACAAGGGTACAAACAACACAG-3’[0096]NbWRKY7下游引物：SEQ ID NO.12[0097]5’-GGTTGCATTTGGTTCATGTAAG-3’[0098]NbWRKY8上游引物：SEQ ID NO.13[0099]5’-AACAATGGTGCCAATAATGC-3’[0100]NbWRKY8下游引物：SEQ ID NO.14[0101]5’-TGCATATCCTGAGAAACCATT-3’[0102]NbEF1a上游引物：SEQ ID NO.15[0103]5’-TGGTGTCCTCAAGCCTG GTA-3’[0104]NbEF1a下游引物：SEQ ID NO.16

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5’-TGCATATCCTGAGAAACCATT-3’

[0106]PCR反应体系包含cDNA 5μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10μL,前后引物各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，水13.8μL。反应程序：I:95度30秒，II:95 度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒，60度1 分钟，95度15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法，检测结果如图6所示。参考文献:Livak, K.J.,and Schmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods 25,402-408.[0107]结果：荧光定量PCR结果表明1μM FoPII1蛋白处理烟草叶片后6h，诱导烟草抗病相关基因的表达量显著升高(如图6)。

[0108]实施例5.植物免疫激活蛋白FoPII1增强烟草和大豆的抗病性[0109](1)FoPII1增强烟草对烟草花叶病毒的抗性[0110]将纯化后的FoPII1溶液稀释到1nM，从叶子背面注入不同的烟草叶片中，以相同浓度的pGEX-4T-2表达的空载体蛋白作为对照，各处理20株，重复3次。诱导24h后，在处理的叶片上注射接种转化有TMV-GFP的农杆菌(添加了GFP标签的TMV，在紫外灯下可发出绿色荧光)，接种3d后统计侵染点数(图7、8)。[0111](2)FoPII1增强大豆对大豆疫霉菌的抗性[0112]将纯化后的FoPII1溶液稀释到1nM，将生长5天的大豆黄化苗浸泡到1nM FoPII1溶液中，25度培养室中遮光处理12h后，取出黄化苗，接种大豆疫霉菌，25度培养室中遮光保湿2天后进行发病症状观察拍照(图9)。每处理10株，重复3次。并取样利用荧光定量PCR进行大豆疫霉菌侵染生物量测定(方法同实施例4)，选择PsActin基因作为大豆疫霉内参基因，GmCYP2基因为大豆内参基因。定量引物序列如下：[0113]GmCYP2上游引物：SEQ ID NO.17[0114]5’-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3’[0115]GmCYP2下游引物：SEQ ID NO.18[0116]5’-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3’[0117]PsActin上游引物：SEQ ID NO.19[0118]5’-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3’[0119]PsActin下游引物：SEQ ID NO.20[0120]5’-CCACCACCTTGATCTTCATG-3’[0121]结果：与pGEX-4T-2表达的空载体蛋白对照相比，使用FoPII1处理的大豆黄化苗在接种大豆疫霉菌后均出现病斑长度显著性减小，大豆疫霉侵染的生物量显著降低(图10)。[0122](3)FoPII1增强大豆对尖孢镰刀菌的抗性[0123]将纯化后的FoPII1溶液稀释到1nM，将生长5天的大豆黄化苗浸泡到1nM FoPII1溶液中，25度培养室中遮光处理12h后，取出黄化苗，接种尖孢镰刀菌，25度培养室中遮光保湿2天后进行发病症状观察拍照(图11)。每处理10株，重复3次。并取样利用荧光定量PCR进行尖孢镰刀菌侵染生物量测定(方法同实施例(4)，选择FoCYP51C基因作为尖孢镰刀菌内参基因。定量引物序列如下：

[0124]FoCYP51C上游引物：SEQ ID NO.21[0125]5’-CTCGAAGGGTAATGGGGAGA-3’

9

CN 110194790 A[0126]

说　明　书

8/9页

FoCYP51C下游引物：SEQ ID NO.22

[0127]5’-ATTGGGATCAGGCTGTTCAA-3’[0128]结果：与pGEX-4T-2表达的空载体蛋白对照相比，使用FoPII1处理的大豆黄化苗在接种尖孢镰刀菌后均出现病斑长度显著性减小，尖孢镰刀菌侵染的生物量显著降低(图12)。

[0129]序列表

[0130]FoPII1编码基因全长核苷酸序列：SEQIDNO.1(DNA序列)尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)序列长750

[0131]Atgaagttcttcgctgctttctctgcccttttggctgtcgcttcagctacgcctactactccttccaagacccttgataaacgagctaccacctggtgt gatgctttcgggtcccttcaaaccgaaggatacaccgtttaccacaacaactggggtagcggccaggctacttccggttctcagtgcactaccttc aactctgtcaagaacaagtccttctcatggtctactaagtggagctgggccggtggaaacatccacgtcaagagctactccaacgtcgctctcga gaacatcaacaagaaggtctcagccatcaagtccatccccacaaagtggacatggcgctacagcggaaccaacatggtttccgatgtatcctac gatctgtggcttgctccctccgtcggtgctgctaacaagtacgagattatgatctgggttggaagctatggtggtgctggccctatctccgactctg gatctactccccttgcgacgctcaccatcaacggcgctcagtggaagctcttccgtggacctaatggcgatactactgtttactctttcgtcgctacc aagaaccagggcaactttgagggcgatcttcttcctttccttacgtaccttaccaagagccagggtgttcctagcagctatgttgccactagcttcc aggccggtactgagcctttcgtgggttccaactgtgtcttctctacctcggcctacagcctctctgtcaactaa

[0132]FoPII1全长蛋白序列：SEQIDNO.2(氨基酸序列)尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)序列长 249

[0133]MKFFAAFSALLAVASATPTTPSKTLDKRATTWCDAFGSLQTEGYTVYHNNWGSGQATSGS QCTTFNSVKNKSFSWSTKWSWAGGNIHVKSYSNVALENINKKVSAIKSIPTKWTWRYSGTN MVSDVSYDLWLAPSVGAANKYEIMIWVGSYGGAGPISDSGSTPLATLTINGAQWKLFRGP NGDTTVYSFVATKNQGNFEGDLLPFLTYLTKSQGVPSSYVATSFQAGTEPFVGSNCVFSTSA YSLSVN[0134]SEQ ID NO.3(DNA人工序列Artificial sequence)序列长39[0135]cagctagcatcgattcccatgaagttcttcgctgctttc[0136]SEQ ID NO.4(DNA人工序列Artificial sequence)序列长38[0137]aatctctagaggatccccgttgacagagaggctgtagg[0138]SEQ ID NO.5(DNA人工序列Artificial sequence)序列长40[0139]tccccagga attccc atgtcgcccaccactccctccaaga[0140]SEQ ID NO.6(DNA人工序列Artificial sequence)序列长36[0141]cgctcgagtcgaccc gttgacagacagactgtaggc[0142]SEQ ID NO.7(DNA人工序列Artificial sequence)序列长19[0143]ccgcaccatgtccttagag[0144]SEQ ID NO.8(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20[0145]cttgccccttgagtacttgc[0146]SEQ ID NO.9(DNA人工序列Artificial sequence)序列长24[0147]aattcggccatcgtgatcttggtc

10

CN 110194790 A[0148][0149][0150][0151][0152][0153][01][0155][0156][0157][0158][0159][0160][0161][0162][0163][01][0165][0166][0167][0168][0169][0170][0171][0172][0173]

说　明　书

9/9页

SEQ ID NO.10(DNA人工序列Artificial sequence)序列长24gagaaactgggattgcctgaaggaSEQ ID NO.11(DNA人工序列Artificial sequence)序列长22cacaagggtacaaacaacacagSEQ ID NO.12(DNA人工序列Artificial sequence)序列长22ggttgcatttggttcatgtaagSEQ ID NO.13(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20aacaatggtgccaataatgcSEQ ID NO.14(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21tgcatatcctgagaaaccattSEQ ID NO.15(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20tggtgtcctcaagcctg gtaSEQ ID NO.16(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21tgcatatcctgagaaaccattSEQ ID NO.17(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21cgggaccagtgtgcttcttcaSEQ ID NO.18(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21cccctccactacaaaggctcgSEQ ID NO.19(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20actgcaccttccagaccatcSEQ ID NO.20(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20ccaccaccttgatcttcatgSEQ ID NO.21(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20ctcgaagggtaatggggagaSEQ ID NO.22(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20attgggatcaggctgttcaa。

11

CN 110194790 A

序　列　表

1/5页

序列表<110> 南京农业大学<120> 尖孢镰刀菌分泌的植物免疫激活蛋白FoPII1及其应用<160> 22<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 750<212> DNA<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)<400> 1atgaagttct tcgctgcttt ctctgccctt ttggctgtcg cttcagctac gcctactact 60ccttccaaga cccttgataa acgagctacc acctggtgtg atgctttcgg gtcccttcaa 120accgaaggat acaccgttta ccacaacaac tggggtagcg gccaggctac ttccggttct 180cagtgcacta ccttcaactc tgtcaagaac aagtccttct catggtctac taagtggagc 240tgggccggtg gaaacatcca cgtcaagagc tactccaacg tcgctctcga gaacatcaac 300aagaaggtct cagccatcaa gtccatcccc acaaagtgga catggcgcta cagcggaacc 360aacatggttt ccgatgtatc ctacgatctg tggcttgctc cctccgtcgg tgctgctaac 420aagtacgaga ttatgatctg ggttggaagc tatggtggtg ctggccctat ctccgactct 480ggatctactc cccttgcgac gctcaccatc aacggcgctc agtggaagct cttccgtgga 0cctaatggcg atactactgt ttactctttc gtcgctacca agaaccaggg caactttgag 600ggcgatcttc ttcctttcct tacgtacctt accaagagcc agggtgttcc tagcagctat 660gttgccacta gcttccaggc cggtactgag cctttcgtgg gttccaactg tgtcttctct 720acctcggcct acagcctctc tgtcaactaa 750<210> 2<211> 249<212> PRT<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)<400> 2Met Lys Phe Phe Ala Ala Phe Ser Ala Leu Leu Ala Val Ala Ser Ala1  5  10  15Thr Pro Thr Thr Pro Ser Lys Thr Leu Asp Lys Arg Ala Thr Thr Trp 20  25  30Cys Asp Ala Phe Gly Ser Leu Gln Thr Glu Gly Tyr Thr Val Tyr His 35  40  45Asn Asn Trp Gly Ser Gly Gln Ala Thr Ser Gly Ser Gln Cys Thr Thr 50  55  60Phe Asn Ser Val Lys Asn Lys Ser Phe Ser Trp Ser Thr Lys Trp Ser65  70  75  80

12

CN 110194790 A

序　列　表

2/5页

Trp Ala Gly Gly Asn Ile His Val Lys Ser Tyr Ser Asn Val Ala Leu 85  90  95Glu Asn Ile Asn Lys Lys Val Ser Ala Ile Lys Ser Ile Pro Thr Lys 100  105  110Trp Thr Trp Arg Tyr Ser Gly Thr Asn Met Val Ser Asp Val Ser Tyr 115  120  125Asp Leu Trp Leu Ala Pro Ser Val Gly Ala Ala Asn Lys Tyr Glu Ile 130  135  140Met Ile Trp Val Gly Ser Tyr Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Asp Ser145  150  155  160Gly Ser Thr Pro Leu Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Gln Trp Lys 165  170  175Leu Phe Arg Gly Pro Asn Gly Asp Thr Thr Val Tyr Ser Phe Val Ala 180  185  190Thr Lys Asn Gln Gly Asn Phe Glu Gly Asp Leu Leu Pro Phe Leu Thr 195  200  205Tyr Leu Thr Lys Ser Gln Gly Val Pro Ser Ser Tyr Val Ala Thr Ser 210  215  220Phe Gln Ala Gly Thr Glu Pro Phe Val Gly Ser Asn Cys Val Phe Ser225  230  235  240Thr Ser Ala Tyr Ser Leu Ser Val Asn 245<210> 3<211> 39<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3cagctagcat cgattcccat gaagttcttc gctgctttc 39<210> 4<211> 38<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4aatctctaga ggatccccgt tgacagagag gctgtagg 38<210> 5<211> 40<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5

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序　列　表

3/5页

tccccaggaa ttcccatgtc gcccaccact ccctccaaga 40<210> 6<211> 36<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6cgctcgagtc gacccgttga cagacagact gtaggc 36<210> 7<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7ccgcaccatg tccttagag 19<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8cttgcccctt gagtacttgc 20<210> 9<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9aattcggcca tcgtgatctt ggtc 24<210> 10<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10gagaaactgg gattgcctga agga 24<210> 11<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11cacaagggta caaacaacac ag 22<210> 12<211> 22

14

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序　列　表

4/5页

<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12ggttgcattt ggttcatgta ag 22<210> 13<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13aacaatggtg ccaataatgc 20<210> 14<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 14tgcatatcct gagaaaccat t 21<210> 15<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 15tggtgtcctc aagcctggta 20<210> 16<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 16tgcatatcct gagaaaccat t 21<210> 17<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 17cgggaccagt gtgcttcttc a 21<210> 18<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 18

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序　列　表

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cccctccact acaaaggctc g 21<210> 19<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 19actgcacctt ccagaccatc 20<210> 20<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 20ccaccacctt gatcttcatg 20<210> 21<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 21ctcgaagggt aatggggaga 20<210> 22<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 22attgggatca ggctgttcaa 20

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图1

图2

图3

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图4

图5

图6

图7

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图8

图9

图10

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图11

图12

20