海藻类功能食品对实验小鼠肠道菌群结构及非特异性免疫指标的影响

doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2019.23.005

海藻类功能食品对实验小鼠肠道菌群结构及非特异性免疫指标的影响

徐明军摇辛摇毅摇刘丽坤摇吴大畅摇(大连医科大学基础医学院,大连116044)

摇摇中图分类号摇R392郾11摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2019)23鄄2837鄄05

[摘摇要]摇目的:探讨海藻类功能食品对肠道微生态失调小鼠的菌群调整及对非特异性免疫的调节作用,以进一步开发利用海洋藻类资源。方法:将SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组和干预组,干预组首先采用大剂量混合抗生素灌胃建立小鼠肠道微生态失调模型,再根据后期干预方式的不同分为:模型组、自然恢复组(正常喂养)和治疗组(海藻糖类配方鼠粮喂养);收集各组小鼠新鲜粪便,利用PCR鄄DGGE方法检测肠道菌群结构变化,获得细菌群落指纹图谱并进行分析,同时切取差异显著条带进行序列分析;酶联免疫吸附实验检测血清中IL鄄2、TNF鄄琢生成水平,进而初步评价海藻类食品对小鼠非特异性免疫的影响。结果:抗生素灌胃后导致小鼠肠道菌群失调,相关免疫细胞因子水平下降,模型组小鼠体内Barnesiellaintestinihominis等抑制机体免疫力的菌群量明显高于正常及治疗组,治疗组小鼠乳酸杆菌等有益菌及肠道菌群多样性恢复较好且小鼠血清细胞因子浓度明显升高。结论:海藻类功能食品能够帮助恢复肠道微生态平衡,增强实验小鼠免疫功能。

[关键词]摇海藻;功能食品;免疫低下;肠道菌群;微生态

Effectsofalgalfunctionalfoodonintestinalmicrofloraandnonspecificimmunityinmicewithintestinalfloraimbalance

XUMing鄄Jun,XINYi,LIULi鄄Kun,WUDa鄄Chang郾CollegeofBasicMedicalSciences,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China

withintestinalfloraimbalanceinducedbymultiple鄄antibiotics,tofurtherdevelopandutilizetheresourcesofmarinealgae郾Methods:TotalofKunmingmicewererandomlydividedintonormalcontrolgroup,modelgroup,naturalrecoverygroup(normalfeeding)andtreatmentgroup(functionalfoodfeeding)郾Theintestinalmicrobeimbalancemicewereestablishedbyintragastricadministrationofmultiple鄄highdoseantibiotics郾ThefreshfecesofeachmousewerecollectedandthefingerprintsoftheintestinalflorawereobtainedbylevelofserumcytokinesIL鄄2andTNF鄄琢weredetectedbyenzyme鄄linkedimmunosorbentassayandtoevaluatetheeffectofalgal

[Abstract]摇Objective:Toinvestigatetheintestinalmicrofloraandnonspecificimmunityeffectofalgalfunctionalfoodinmice

PCR鄄DGGEandanalysedbyrelatedsoftware郾Significantlydifferentbandswerecutofftodofurthersequencinganalysis郾Theproductionfunctionalfoodonnonspecificimmunityinmice郾Results:Themiceintestinalmicrobiotaweredisorderedafterbeingfedwithantibioticsimportantimmune鄄inhibitingbacteriawasobviouslyhigherthanthatofnormalandtreatmentgroup郾Aftertreatmentfecallactobacillus

andthelevelofrelatedcytokinesdropped郾TheamountofBarnesiellaintestinihominisinmodelgroupmicefecalwhichactasanbacteriaandintestinalfloradiversitywereallbetterrecovered,andserumconcentrationsofcytokinesinmiceincreasedsignificantly郾Conclusion:Algalfunctionalfoodisbeneficialtotherecoveryoflowerimmunityandreconstructionofintestinalmicrobiotainmiceinducedbyantibiotics郾

[Keywords]摇Algal;Functionalfood;Immunosuppression;Intestinalflora;Microecology

摇摇机体是一个巨大的微生态系统,其中肠道菌群发挥着生物拮抗、免疫调节、维持微生态系统稳定等重要作用[1]。抗生素的过量、不合理应用容易造成肠道菌群紊乱及细菌易位,进而引发机体内源性感染、免疫力低下[2]。目前,基于恢复肠道微生态菌群平衡、用于该类疾病治疗的微生态制剂主要有:益

作者简介:徐明军,女,在读硕士,主要从事肠道微生态学研究,通讯作者及指导教师:吴大畅,女,博士,副教授,主要从事微生物学

方面研究,E鄄mail:dachangwu@163.com。

E鄄mail:2719469527@qq.com。

生菌(Probiotics)、益生元(Prebiotics)和合生元(Syn鄄biotics)。

来源于海洋藻类、真菌(蘑菇)以及某些陆生植

物的多糖物质,对人体肠道菌群具有重要的调节作用。然而,国内对于该类功能性食品的开发应用却远远落后于对肠道益生菌的研发。来源于食品的益生元能够维持肠道微生态的稳态,促进益生菌的定植,从而提高机体免疫力,促进人体健康[3]。经过大量的文献检索,我们发现国内对于功能性食品的基础研究亦很有限,虽然生产企业对于功能性食品

·2838·中国免疫学杂志2019年第35卷

的开发相对较多,但更多的是针对单一组分的开发,对于多组分配方产品的研究相对较少。基于此,本研究通过大剂量抗生素冲击法建立小鼠肠道菌群失衡模型;将浒苔、香菇等按一定比例混合制备以海藻为主要成分的功能食品,观察海藻类功能食品对肠道菌群失调实验小鼠菌群重建及非特异性免疫的影响,为开发以浒苔等海洋藻类为主要原料的健康食品提供实验依据和基础。

养。免疫低下组小鼠用抗生素(甲硝唑片、阿莫西林胶囊、盐酸左氧氟沙星片按4颐5颐1的剂量比用生理盐水混合,每天灌胃2次,每只小鼠一次灌胃200滋l)灌胃2周。正常组小鼠灌胃同体积生理盐水2周。造模成功的小鼠(体重较正常组降低,肠道菌群检测与正常组比较有明显改变)再随机分为模型组7只,自然恢复组7只,配方食品治疗组7只,自然恢复组正常喂食1周,治1郾2郾3摇肠道菌群结构分析疗组喂食海藻配方鼠粮1周。

1摇材料与方法

1郾1摇材料

1郾1郾1摇实验动物摇健康4周龄,雄性,体重18~动物中心20g的SPF,实验前适应性喂养级昆明种小鼠,购于大连医科大学实验1郾1郾2摇仪器和试剂摇UVS鄄1涡旋振荡器1周。

(北京优晟科技有限公司);HC鄄3018R高速冷冻离心机(离心半径6cm)(安徽中科中佳科学有限公司);JY鄄spat琼脂糖电泳仪、Dcode变性梯度凝胶系统(大连竞迈生物科技有限公司);甲硝唑片(北京秦武田制药有限公司,批号:H110224);阿莫西林胶囊(哈药集团制药总厂(哈药集团,三批号精制:H23020932);药诺捷有限盐酸左氧氟沙星片H200408);粪便细菌DNA提取试剂盒责任公(司成都福际,批号:341F、518R生物技术有限公司);PCR引物合成:GC鄄341F、

EasyTaq公司);DL2000PCR(英SuperMix(潍捷基上Marker、DL100北京全式金生物技术有限海贸易有限公司);2伊Marker(大连宝生物工程有限公司);小鼠白介素(IL鄄2)酶联免疫吸附测定试剂盒琢)(Elabscience)、小鼠肿瘤坏死因子琢(限公司酶联免疫吸附测定试剂盒);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(上海朗顿生物科技有TNF鄄、尿素、去离子甲酰胺、琼脂糖、溴化乙锭(大连羽铭生物科技有1郾限公司2摇实验方法)。

1郾2郾1摇海藻糖类配方鼠粮的制备摇按以下比例制备海藻糖类原料200g:浒苔15%、鹿角菜15%、裙5%带菜15%、香菇15%、滑菇10%、舞菇10%、刺五加

烘干粉碎成粉末状、青蒿5%、海参干粉。将以上海藻糖类原料与正常成5%、蛹虫草5%。经清洗分鼠粮以1颐2的比例混合制成配方鼠粮:即取普通鼠粮400g,浸泡6h搅匀成糊状,将两者充分混合,1郾烘干后成配方鼠粮2郾2摇抗生素所致肠道菌群。

失衡小鼠模型的建立与分组摇将28只小鼠随机分为正常对照组7只,免疫低下组21只。正常组给予普通饲料喂1郾2郾3郾1摇粪便细菌总DNA提取摇留取各组小鼠新鲜粪便,收集于无菌EP管,-80益保存备用。严格按照试剂盒操作说明提取各组小鼠粪便细菌1郾总2郾DNA。

3郾2摇PCR扩增摇利用PCR过程扩增粪便菌群基因组的16SrRNA基因的V3可变区序列,参考通用引物CCTACGGGAGGCAGCAG鄄3忆)、序列如下:上游引物:GC鄄341FATTACCGCGGCTGG鄄3忆),为其中“下游引物(5忆鄄GC夹鄄GC夹冶40:518Rbp,序列(5忆鄄上下游引物ACGGGGGG。CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC鄄10扩增体系pmol/滋l(50各2滋l)滋l,为ddH:DNA2O模板18滋l,23滋l,PCR变性SuperMix5min;94益25变性滋l。30PCRs,益扩增条件退火30:首先s,72益,94益延伸预伊30物置s,进行4益保35存个循环,2%琼;最后脂糖72益凝胶延伸电泳7进min。行检扩增产2测,以增反应成功000bpMarker。

为参照,出现清晰目标条带说明扩1郾60%2郾3郾3摇变性梯度凝胶电泳(DGGE)摇配制30%~60益凝胶成像、80DGGEV电泳变性梯度凝胶5h后,取出凝胶使用,PCR产物于EBDGGE染色胶(Phoretix,系NewcastleuponTyne,统检测并采集图UK)像。软利件用分Phoretix1D,于DGGE图像。

析PCR鄄1郾2郾3郾4摇差异显著条带序列分析摇以无菌手术刀片切下DGGE图谱中差异显著条带于EP管中,加入20滋l无菌水并捣碎,于95益浸泡10min后37益过夜,取上清液作模板,以无GC夹的341F为上游引物,其余完全同前进行PCR扩增。产物通过2%琼Invitrogen(脂糖凝胶电泳,切胶后进行回数据库(http:北京)/公司测序/www郾ncbi郾。nlm郾序列拼接后在收纯nih郾gov/)GenBank化,由Blast比对分析。

中进行1郾2郾4摇小鼠血清细胞因子水平测定摇于每组小鼠处理结束后进行眼球采血,37益水浴20min后徐明军等摇海藻类功能食品对实验小鼠肠道菌群结构及非特异性免疫指标的影响摇第23期·2839·

3000r/min离心10min,收集血清,-20益保存备用。测定时以血清样品稀释液稀释血清,小鼠血清法,严格按照试剂盒操作说明进行测定。

炎性因子TNF鄄琢、IL鄄2表达水平测定采用ELISA方1郾3摇统计学处理摇采用SPSS17郾0统计软件进行统计分析,实验数据以x依s表示,进行方差分析,以P<0郾05为差异具有显著统计学意义。

否造模及喂养方式的不同分别聚成一簇,其中1、2号属于玉组,4~6号为域组,7~9号是芋组,10~122郾3摇条带测序结果摇对DGGE图谱中差异显著的条带经切离、克隆、测序、GenBank数据库比较分析后,结果如表2所示。A条带代表乳酸菌属细菌,其在正常对照组及治疗组小鼠粪便中含量较高;B条带为Barnesiellaintestinihominis(一种与多种疾病发生及肠黏膜免疫低下密切相关的紫单胞菌科细菌),其含量在模型组显著高于正常对照组和治疗号是郁组。

2摇结果

2郾1摇抗生素所致肠道菌群失衡模型的建立摇小鼠经抗生素灌胃2周后,精神状态萎靡,体重明显下降,同时便型变得稀软,PCR鄄DGGE结果提示菌群结构较正常组发生明显改变(图1),TNF鄄琢、IL鄄2表达水平明显下降(P<0郾05,表1)。

2郾2摇PCR鄄DGGE电泳结果摇图1为小鼠粪便细菌总DNA的PCR鄄DGGE电泳结果:同一泳道不同的条带代表不同菌群,条带灰度反映菌群相对数量的多少。正常对照组(1~3)条带数较多,多样性丰富;肠道菌群失衡模型组(10~12)条带数目及单一条带的灰度值均明显下降,与正常组比较存在统计学意义(P<0郾01),且在模型组出现均一的特征性条带(7B。经喂食海藻类功能性食品后,可见治疗组趋近于正常对照组~9)的条带数目及灰度明显增强,并出现特异性增强条带,其图谱类型更C。自然恢复组(4~6)虽然条带多样性增强,有预后表现,但其效果仍不如海藻类功能食品的治疗组,特别是特异性条带A所代表的菌群恢复程度较差。使用Phoretix1D软件对小鼠肠道菌群DGGE图谱进行UPGMA相似性聚类分析,由结果可见:1~12条带构成了有统计学意义的四簇谱图。小鼠按照是

图1摇粪便细菌PCR鄄DGGE电泳图谱

Fig.1摇PCR鄄DGGEprofilingoffecalmicrobiota

Note:19郾-Treatment3郾Normalgroup;10-12郾controlgroup;Model4-6郾groupNatural郾

recoveringgroup;7-组;C条带为普氏菌属细菌(一种中性菌),治疗组小鼠粪便中普氏菌与正常组比较略有增高,而模型组和自然恢复组该类菌的含量较正常对照组明显下调。以上结果均提示,抗生素处理后小鼠肠道菌群结构与正常对照组相比发生显著改变,应用功能食品治疗后小鼠肠道菌群较模型组有明显差异,其变化更接近于正常组,治疗效果明显。

2郾4摇相关细胞因子水平摇由表1可知抗生素能显著降低小鼠血清细胞因子IL鄄2、TNF鄄琢的水平,模型组小鼠的IL鄄2和TNF鄄琢的表达量均显著低于对照组(P<0郾05),而海藻类功能食品可以显著提高小鼠血清IL鄄2和TNF鄄琢水平,其产生量接近正常水平,与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0郾05)。该结果表明,抗生素在导致小鼠菌群失衡的同时,降低其免疫能力,而海藻类功能食品能够调节小鼠免疫低下状态。

表1摇小鼠血清相关免疫细胞因子表达水平(x依s,n=7)Tab.1摇Expressionlevelsofinflammatoryfactorsinmice

serum(x依s,n=7)

NormalGroups

controlgroupIL鄄2

TNF鄄琢

NaturalModelgroup0郾0郾依0郾77依0郾04031)240郾208郾19依11郾11依8郾44251)

Note:ComparedTreatmentrecoveringgroupgroup

0郾withnormalcontrol0郾83依0郾88依0郾03224郾59依9郾47

group,1032)

)摇237郾88依8郾732)

modelgroup,2)P<0郾05郾

P<0郾05;comparedwith

表2摇DGGE差异显著条带对应的细菌V3区测序结果Tab.2摇IdentificationbysequenceofV3fragmentsexcised

fromDGGEsignificantdifferencebandsoftotalmicrobialcommunity

SelectedAband

Blastresult

BacteriaphylumBacteriaBBarnesiellaLactobacillusintestinihogasseriC

PrevotellamicansminisBacteroidetes

Firmicutes

LactobacillusgenusSimilarityBacteroidetes

Barnesiella98%Prevotella

88%92%

·2840·中国免疫学杂志2019年第35卷

3摇讨论

多种天然产物具有益生元样作用,且其来源广泛、疗效独特、毒副作用小,具有“已病治病,未病防病,无病强身冶的特点。海藻中含有较多的多糖纤维素、少量脂肪、丰富的无机盐和维生素。多糖提取物被诸多研究证明对人体健康有益,多糖也被认为是一种免疫调节剂[4],而不同来源的多糖提取物具有抗癌、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗炎等多种活性[5鄄8]。海藻来源广泛,热能低,尤其适合于老年人

导致益生菌数量大大下降,营养物质消化吸收不良,粪便蓄积,小鼠肠道免疫功能下降。海藻类功能食品中可能存在一定的免疫刺激因子,促进免疫细胞抵御吞噬作用并调节细胞因子的正常分泌,进而发挥增强免疫作用。海藻类功能食品作为一种新型免疫增强剂具有良好的开发应用前景,但其具体作用机制仍需要深入探讨。

参考文献:

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。

的广泛关注,但有关天然产物对肠道菌群和免疫的影响相关研究不多。本实验从肠道微生态的角度来研究海藻类功能食品的免疫调节作用,采用抗生素构建肠道菌群失衡模型,研究海藻类功能食品对小鼠免疫细胞因子分泌水平的影响。结果表明:抗生素灌胃后导致小鼠肠道菌群失调,相关免疫细胞因子水平下降,模型组小鼠体内Barnesiellaintestinihominis等抑制机体免疫力的菌群量明显高于正常及治疗组,治疗组小鼠乳酸杆菌等有益菌及肠道菌群多样性恢复较好且小鼠血清细胞因子浓度明显升高,以上指标变化均优于自然恢复组。综上可知:海藻类功能食品对于提高小鼠免疫力有显著效果。

当机体免疫功能改变时,也常常伴随着肠道微生态的破坏,而肠道微生态破坏的主要表现即肠道菌群的失调

[10鄄12]

相应的改变。Daill侉re,同时血清中细胞因子浓度也会有

等[13]的研究结果显示,Barnesiellaintestinihominis属巴氏杆菌属,能改变肿瘤微环境,降低调节性T细胞浓度和刺激同源抗肿瘤CTL应答,具体作用机制可能与万古霉素耐药肠球菌的清除有关。乳酸杆菌(Lacticacidbacteria)可发酵碳水化合物(主要为葡萄糖),产生大量乳酸,具有提高机体免疫力,调节机体特异性及非特异性免疫的作用,是广泛应用的益生菌[14]型组小鼠体内Barnesiellaintestinihominis。本实验中模明显高于治疗组及正常对照组,经海藻多糖喂食的小鼠肠道菌群与对照组小鼠相比肠道菌群多样性及有益菌恢复较好。IL鄄2为T细胞生长因子,能够活化Th1细胞,促进CTL的增殖,参与抗体反应;TNF鄄琢能够促进T和B淋巴细胞增生。本实验中,功能食品可提高血清中IL鄄2和TNF鄄琢的表达水平,进而增强了机体免疫功能。

综上,在应用抗生素建立肠道菌群失衡模型后,

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