高温胁迫对高羊茅草坪草氮代谢影响的初步研究

高温胁迫对高羊茅草坪草氮代谢影响的初步研究**

宋子健，李良霞，李建龙*，张强

南京大学生命科学院，南京 (210093）

E-mail：jlli2008@nju.edu.cn

摘 要：通过盆栽试验，以两种耐热性不同的高羊茅（热耐受型美洲虎3号和热敏感型TF66）为材料，研究了高温逆境（35/30°C，白/昼，20d）对高羊茅叶片内总氮量、硝态氮含量和氨态氮含量、以及参与氮同化和代谢过程的主要酶活性的影响，结果表明高温胁迫下：（1）两种高羊茅叶片总氮量和硝态氮含量降低，氨态氮含量升高； （2）两高羊茅叶片内还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）活性均持续下降，谷氨酸合成酶（GOGAT） 活性均先升后降； （3）高温胁迫20d时美洲虎3号叶片内谷氨酸脱氢酶（GDH）活性较对照下降了34.14%,而TF66叶片内GDH较对照上升了51.94%, 表明TF66可能启动了通过谷氨酸脱氢酶同化铵的途径； （4）高温胁迫20d时两高羊茅草种叶片内硝态氮含量、氨态氮含量、NR活性、GDH活性差异显著。综合上面的试验结果，可知高温胁迫对耐热性不同的两种高羊茅氮代谢的影响有所差异，这为筛选出耐热性强的高羊茅生理生态指标提供了理论基础。

关键词：高温胁迫；高羊茅；氮代谢；氮含量；酶活性

中图分类号：S566.109 文献标识码：A

氮代谢是植物的基本生理过程之一，植物的生长、繁殖所需要氨基酸、蛋白质、核酸和其他的细胞成份的合成都牵涉到氮代谢[1]。植物体氮的同化作用，需要吸收盐（NO3-），还原成亚盐（NO2-）， 再由亚盐（NO2-）转化为铵（NH4+）, 最后以NH4+的形式结合进入有机化合物之中[2]。植物完成这个代谢过程需要还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酰胺合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶（GDH）等关键酶的催化和调节。

已有的研究表明，许多非生物胁迫都可以影响植物的氮代谢过程。一般来说，逆境胁迫下不同植物都大体表现为总氮含量降低[3-4]，NH4+含量增加，NR酶活性降低，蛋白质降解增加，蛋白质合成和积累受到抑制[5

，6，7，8]

，还原酶（NR），亚盐还原酶（NiR），

谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）受到强烈抑制[9]。高温胁迫能够影响草坪草的很多生理生化过程[10-11]，目前关于高温胁迫对冷季型草坪草的影响的研究主要集中在抗氧化物体系，光合作用速率和糖类代谢的影响。然而，关于高温胁迫对冷季型草坪草氮代谢的影响则鲜有报道。氮代谢是关系到草坪草生长和发育的重要代谢，研究高温胁迫对高羊茅草坪草的氮代谢有着非常重要的理论和现实意义。本试验研究高温胁迫对2个高羊茅品种（Festuca arundinacea Schreb），耐热型美洲虎 3 号 和热敏感型TF66的氮代谢的影响，诣在揭示高温逆境与高羊茅氮代谢的关系及其作用机理，并为高羊茅筛选出抗热性强的生理生化指标。

1 材料和方法

1.1实验材料

供试材料是冷季型草坪草品种美洲虎 3 号 和 TF66，草种由克劳沃草业集团提供。

1.2试验处理

选择健康的美洲虎3号和TF 66草种播种在装有混合培养基质（沙子：蛭石：有机营养 本课题得到江苏省农业三项工程项目（SX（2005）098的资助。

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土=3：1：1）的聚乙烯花盆中。花盆直径为20cm，深6cm,每个品种重复栽培12盆。高温胁迫前，放在全自动光照培养箱中，保持20/15℃ （白/昼）的恒温，每天以400 µmol m-2 s-1的强度光照14h，培养70d。70d后将植株平均分为两部分：一部分维持原来的培养条件，作为对照组；另一部分转移到到高温 35/30℃ （昼/夜）的光照培养箱中培养20d。其他供试样品维持原来培养条件，作为对照组。在正常培养和高温胁迫过程中，每周施以Hoagland全元素营养液[12]。分别在高温胁0d、10d、20d取样，测定相应指标。

1.3测定指标

取5 mg磨碎的干燥叶片材料用元素分析仪(CHN-O-Rapid)，分析其总氮含量；叶片硝态氮浓度的测定参照Cataldo[13]的方法；叶片氨态氮浓度的测定参照Krom[14]的方法；还原酶（NR）的测定利用Silveira等介绍的方法[15]；谷氨酸合成酶（GOGAT）的测定按照Singh和Srivastava的方法进行[16]；GS 的测定参照Pèrez-Soba等的方法进行[17]；GDH的活性测定参照Majerowicz等的方法进行[18]；氨基酸的分离和测定用带阳离子交换树脂柱(Benson D-×8.25 bed size 200×2.8mm)的Beckman Model 121 MB氨基酸分析仪(Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA)完成；可溶性蛋白的测定用Bradford[19]的方法进行。

1.4 统计分析

使用SPSS软件(SPSS Inc. 1990)进行数据的统计分析，利用Duncan多样性比较检验进行方差分析（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片总氮、硝态氮和氨态氮含量的影响

2.1.1高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片总氮含量的影响

许多环境胁迫因子可以影响植物根系对氮的吸收和植物对氮的同化利用[7]。高温胁迫下两高羊茅品种的总氮含量见图1。高温胁迫10d时, 美洲虎3号和TF66的总氮含量较对照都有少量下降,但变化均不显著(P>0.05),胁迫20d时,美洲虎3号和TF66的总氮含量都急剧下降,分别较对照降低17.80%和14.28%,无论是胁迫10d还是20d,两高羊茅品种的总氮含量差异均不显著(P>0.05) 。

65总氮含量（%）43210高温胁迫前对照10天处理10天对照20天处理20天JaguarTF 66 图1高温胁迫10d天和20d后美洲虎3号和TF66的总氮含量 Fig. 1 levels of total nitrogen of Jaguar 3 and TF 66 after 10d and 20d heat stress

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2.1.2高温胁迫对高羊茅草坪草叶片硝态氮含量的影响

硝态氮是植物氮代谢的源头,植物对硝态氮的利用速度反映氮代谢的快慢。由图2可知,高温胁迫10d时，美洲虎3号和TF66的硝态氮含量迅速增加，分别较对照增加了49.11%和53.81%,在后续10d的高温胁迫下，硝态氮含量都明显降低，但热敏感型TF66的降低幅度显著大于热耐受型美洲虎3号(P<0.05)。常温和高温胁迫后，美洲虎3号的硝态氮含量都高于同等水平下的TF66。

硝态氮含量 (µ mol g-1 FW)4035302520151050高温胁迫前对照10天处理10天对照20天处理20天 JaguarTF 66 图2 高温胁迫10d和20d后美洲虎3号和TF 66的硝态氮含量 Fig. 2 levels of nitrate of Jaguar 3 brand and TF 66 after 10d and 20d heat stress

2.1.3高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片氨态氮含量的影响

铵态氮是合成氨基酸的重要原料。但植物体内铵态氮的大量积累会对植物造成毒性伤害。由图3可知，高温胁迫下两高羊茅品种的铵态氮含量均比对照有明显增加。高温胁迫10d和20d时，美洲虎3号的铵态氮含量分别较对照增加10.01%和5.7%(P>0.05),但TF66分别较对照增加18.71%和44.70%(P<0.05)。高温胁迫10d时，两高羊茅品种的铵态氮含量差异不大(P>0.05)，胁迫20d时，美洲虎3号积累的铵态氮含量比TF66的低(P<0.05)。

180160氨态氮含量（μmol DgW)140120100806040200高温胁迫前对照10天处理10天对照20天处理20天-1JaguarTF 66

图3高温胁迫10d和20d后美洲虎3号和TF 66氨态氮含量

Fig. 3 levels of ammonium of Jaguar 3 brand and TF66 after 10d and 20d heat stress

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2.2高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片还原酶（NR）活性的影响

NO3--N是植物吸收氮的主要形式，还原酶（NR）是将NO3--N转化成NH4+-N的关键酶。NR的高低直接关系到植物对氮的利用。由图4可知，高温胁迫降低了两种草坪草NR活性，但高温胁迫10d时,美洲虎3号和TF66的NR酶活性变化不明显（P>0.05）,高温胁迫20d时都显著降低（P<0.01），分别较对照降低了45.38%和49.11%，这种降幅在两高羊茅品种之间没有明显差异，但热敏感型TF66 NR的活性总是大于经过同样处理的热耐受型美洲虎3号。

120NR(NO2-µg·gFW－1·h－1)100806040200高温胁迫前对照10天处理10天对照20天处理20天JaguarTF 66 图4高温胁迫10d和20d后美洲虎3号和TF 66还原酶活性 Fig. 4 Enzyme activities of NR of Jaguar 3 and TF66 after 10d and 20d heat stress

2.3高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影响

业已证明谷氨酰胺合成酶(GS)是催化谷氨酰胺与α-酮戊二酸形成谷氨酸的酶，NH4+-N的同化主要通过谷氨酰胺合成酶（GS）/ 谷氨酸合成酶（GOGAT）循环途径，所以GS的活性大小直接影响铵的代谢速度。由图5可知，高温胁迫下，美洲虎3号和TF66的GS活性均降低。胁迫10d时，美洲虎3号的GS活性下降幅度极显著大于TF66（P<0.01），但胁迫20d时，两高羊茅品种的GS活性差异不显著（P>0.05），且美洲虎3号的下降幅度已经小于TF66，分别较对照下降了.60%和72.61%。

GS(µmoles of GH formed per g-1fresh wt (FW) h-1)3.532.521.510.50高温胁迫前 对照10天处理10天对照20天 JaguarTF 66 处理20天图5高温胁迫10d和20d后美洲虎3号和TF66谷氨酰胺合成酶活性 Fig. 5 Enzyme activities of GS of Jaguar 3 and TF 66 after 10d and 20d heat stress

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2.4高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的影响

谷氨酸合成酶（GOGAT）是谷氨酰胺合成酶（GS）/ 谷氨酸合成酶（GOGAT）循环途径的重要酶，其活性高低也影响铵的代谢速度。由图6可知，高温胁迫对美洲虎3号GOGAT活性的影响大于TF66。高温胁迫10d时，美洲虎3号和TF66的谷氨酸合成酶（GOGAT）活性均升高，分别较对照增加了60.37%和13.23%,两高羊茅品种增幅差异显著(P<0.05), 胁迫20d时，其GOGAT活性较对照均降低。

GOGAT(µmol NADH oxidized mg-1protein min-1)1.210.80.60.40.20高温胁迫前 对照10天 处理10天对照20天 JaguarTF 66 处理20天图6高温胁迫10d天和20d后美洲虎3号和TF 66谷氨酸合成酶活性 Fig. 6 Enzyme activities of GOGAT of Jaguar 3 and TF 66 after 10d and 20d heat stress

2.5高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的影响

谷氨酸脱氢酶（GDH）有助于TCA循环中间体氧化为α-酮戊二酸，并进一步调节植物体内铵同化过程中的碳供给状况。由图7可知，胁迫10d时，美洲虎3号和TF 66的谷氨酸脱氢酶（GDH）活性变化不显著(P>0.05)。胁迫20d时，美洲虎3号的GDH活性较对照降低了34.18%，而TF 66的GDH活性较对照升高了34.14%,且两高羊茅品种GDH活性差异显著(P<0.05)。

GDH(µmol NADH oxidized mg-1protein min-1)2.521.510.50高温胁迫前 对照10天 处理10天对照20天 JaguarTF 66 处理20天图7高温胁迫10d和20d后美洲虎3号和TF66谷氨酸脱氢酶活性 Fig .7 Enzyme activities of GDH of Jaguar 3 and TF 66 after 10d and 20d heat stress

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3讨论

前人的研究认为植物在环境压力下会减少对氮的吸收[21]。我们的试验结果显示，高温胁迫10d时，两种高羊茅叶片总氮含量减少幅度较小；胁迫20d时均显著降低。这可能是由于长时间的高温胁迫强烈影响高羊茅的氮代谢过程，进而导致总氮含量的降低。

Maevskaya等人研究认为，短期的高温胁迫可以刺激无机氮的活动，从而促进因温度造成的蛋白质细胞结构损伤的修复[22]。本研究表明，高温胁迫10d时，两种高羊茅叶片硝态氮含量都增加，表明高羊茅可以通过迅速积累硝态氮来抵御短期的高温胁迫，以便维持生长；胁迫20d时两种高羊茅叶片硝态氮含量均降低，可能是由于持续的高温胁迫对盐运输环节产生了抑制作用，还可能是由于长期高温对盐吸收所需的ATP的合成产生了抑制作用 [23]。高温胁迫下，热耐受型美洲虎3号和热敏感型TF 66均积累了更多的铵态氮，可能是高温胁迫导致了两种高羊茅铵态氮同化酶GS活性的降低，从而加剧了铵态氮的积累。 热耐受型美洲虎3号积累更多的硝态氮，而热敏感型TF66积累更多的铵态氮，这可能是造成两种高羊茅抗热性差异的原因之一。

还原酶（NR）的作用是催化盐还原为亚盐，它的活性受多种环境因素影响，是植物生长和发育过程中的一个因子[24]，大多数植物在环境压力下还原酶（NR）活性降低[25]。高温胁迫对两种高羊茅NR的活性均有明显的抑制作用，表明高温胁迫可能首先通过抑制NR的活性来影响两种冷季型草坪草的氮代谢。

谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合成酶（GOGAT）循环是同化铵态氮的主要过程。通过这个循环而产生的谷氨酰胺和谷氨酸是植物体内合成包括氨基酸、核酸、叶绿素、多胺和碱基等含氮有机物的前提物质。高温胁迫10d时，美洲虎3号和TF66均通过增强其GOGAT的活性，完成铵的同化；在后续10d的高温胁迫下，两种高羊茅的GS和GOGAT的活性明显下降。这可能是由于长期的高温胁迫导致大量NH4+-N的积累，导致GS和GOGAT活性下降，抑制了铵的同化[26-27]，而GS和GOGAT活性的降低可能会直接导致植物热害的发生。

许多证据表明，GDH有助于TCA循环中间体氧化为α-酮戊二酸，并进一步调节植物体内铵同化过程中的碳供给状况[28-29]。高温胁迫10d时，美洲虎3号和TF66的GDH活性均没有明显的改变，胁迫20d后，美洲虎3号GDH活性降低，而TF66 GDH活性升高。表明GDH可能在热敏感型TF66的铵同化过程中起着重要作用。西红柿受到紫外线照射也产生了相似的现象[30]。

总之，我们的研究表明：长时间的高温胁迫(35/30°C)对两种耐热性不同的高羊茅氮代谢有着不同程度的影响，这为揭示高温胁迫对高羊茅氮代谢的影响提供了理论基础，并为筛选耐热性强的高羊茅生理生化指标提供了科学依据。

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The effect of high temperature on nitrogen metabolism of

tall fescue turfgrass

Song Zijian，Li Liangxia，Li Jianlong，Zhang Qiang

College of Life Science，Nanjing University，Nanjing (210093)

Abstract

In order to understand the effect of high temperature stress on nitrogen metabolism of tall fescue, a pot experiment was carried out using two tall fescue cultivars, Jaguar 3 brand(heat-tolerant) and TF 66(heat-sensitive) . We evaluated the total nitrogen, nitrate content, ammonium content and activities of key enzymes (NR, GS, GOGAT and GDH) related to nitrogen metabolism of two tall fescue cultivars. The results showed that under high temperature stress (1) Total nitrogen content and nitrate content in the leaves of both tall fescue cultivars declined, ammonium content in the leaves of both tall fescue cultivars increased by different extent; (2) Activiities of nitrate reductase(NR), NADH-dependent glutamate synthase(GS) decreased constantly, activities of glutamine synthetase(GOGAT) increased firstly and then declined in the leaves of both tall fescue cultivars; (3) On the twentieth day of high temperature stress, activities of glutamate dehydrogenase(GDH) in leaves of Jaguar 3 brand decreased by 34.14%, while that in leaves of TF 66 increased by 51.94%, indicated that there is an alternative system for assimilation of ammonium through glutamate dehydrogenase in TF66 under longe high temperature stress.; (4) On the twentieth day of high temperature stress, there were significant differences of NR activity, GDH activity, nitrate content and ammonium content between the two control cultivars.Our results indicated that high temperature influenced nitrogen metabolism of two tall fescue cultivars differently ,which contributed some useful insights to select heat-tolerant physiological and ecological index.

Keywords：High temperature stress，Tall fescue，Nitrogen metabolism，Enzyme anctivities

作者简介：

宋子健（1976-），男，汉，东北安徽，硕士研究生，主要研究方向为城市生态学研究； 李建龙，男，汉，教授，主要从事草地生态学与城市生态学研究。

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