一种快速检测镰刀菌DNA的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108949915 A(43)申请公布日 2018.12.07

(21)申请号 201810869124.1(22)申请日 2018.08.02

(71)申请人 河南农业大学

地址 450003 河南省郑州市金水区文化路

95号(72)发明人 高飞　张晓婷　周琳　许娟　

杜鹏强　张艳丽　谢源　李洪连　(74)专利代理机构 福州科扬专利事务所 35001

代理人 林朝熙(51)Int.Cl.

C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页 附图3页

CN 108949915 A(54)发明名称

一种快速检测镰刀菌DNA的方法(57)摘要

本发明涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方

S1：提供特异性识别镰刀菌法，其包括以下步骤：

DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G-四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；S4：引入硫黄素T，诱导产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；检测和记录该荧光。本发明可将疑似含有镰刀菌DNA的小麦待测样品中的核酸信号转化为G-四链体，在常温恒温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。

CN 108949915 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种快速检测镰刀菌DNA的方法，特征在于，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G-四链体互补序列的核苷酸序列；

S2：将所述DNA分子机器与待测样品相混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA新链合成、形成单链切口、不断剥离产生富G序列片段的系列反应；

S4：引入硫黄素T，诱导富G序列片段产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；S5：记录荧光发光情况。

2.如权利要求1所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。

3.如权利要求2所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，且G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。

4.如权利要求3所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于，所述靶序列识别区的序列包括：5’-GTCTTGTCTTCC-3'。

5.如权利要求3所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述切口酶识别区的序列包括5’-…GACTC…-3’，所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；所述G-四链体合成模板序列包括5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC…-3’,所述稳定区的序列包括5’-TGCATC-3’或5’-TTTTTT-3’。

6.如权利要求1所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述S3中，加入dNTP和缓冲液，并置于恒温条件下扩增；所述S4中，加入金属阳离子参与反应。

7.如权利要求6所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述恒温的温度为45-65℃，扩增时间为15-30min。

8.如权利要求1所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述S5中，每隔30s读取一次荧光并记录；所述记录方式为，对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。

9.如权利要求1所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述S2中的所述待测样品的浓度为2～8μM，所述DNA分子机器的浓度为1～120nM，将所述待测样品与DNA分子机器混合均匀，得到混合溶液；

步骤S3中将所述缓冲液10～40μL、聚合酶6～10μL、切口酶6～10μL和dTP3～10μL加入S2中的混合溶液中参与反应，得到反应液；

步骤S4中将所述硫黄素T6～10μL、金属阳离子6～36μL加入到反应液中产生荧光反应。10.如权利要求1-9任意一项所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理步骤包括：剪取100mg植物待测病叶叶片，将待测病叶的叶片置于液研钵中研磨得到组织材料，将所述组织材料固液分离得到植物组织材料，并95℃处理后，得到所需的待测样品。

2

CN 108949915 A

说　明　书

一种快速检测镰刀菌DNA的方法

1/8页

技术领域

[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方法。

背景技术

[0002]镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。[0003]目前，对于镰刀菌的检测的等温可视为检测，大多利用环介导等温扩增测定或者通过PCR法测定。

[0004]尽管恒温扩增技术以其恒温优势以及扩增效率高的特点得到广泛重视，但恒温扩增产物的检测未能突破荧光染料嵌入进行实时分析或凝胶电泳进行终点分析等传统的核酸扩增检测方法，真正意义上实现快速、简单、便携地检测核酸。[0005]传统的荧光标记核酸扩增检测技术，需要进行荧光探针标记，操作繁琐，费时又昂贵并且其灵敏度不高。依托传统技术构建的荧光传感器虽然背景信号低，稳定性强，然而，由于实际样本成分复杂，靶标DNA含量极低，这就要求检测方法具有极高的灵敏度和特异性，常规的荧光标记核酸扩增检测技术的灵敏度和选择性无法满足其检测需求。

[0006]G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四链体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四链体通过π-π堆积形成四链体。[0007]硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性荧光染料，自身荧光信号很低，但在单链、双链或三链DNA/RNA与G-四链体同时存在时，硫黄素T(ThioflavinT，ThT)能够区分不同的核酸类型，对G-四链体具有很强的结构选择性，与G-四链体结合并产生更加稳定的荧光。发明内容[0008](一)要解决的技术问题

[0009]为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种G-四链体分子机器及核酸检测方法。G-四链体生成机器识别靶序列，并在靶序列的牵引之下扩大生成G-四链体，与硫磺素结合产生稳定的荧光，从而将靶序列信号扩大，达到定性的效果。无需荧光探针标记，灵敏度更高，操作更简单。[0010](二)技术方案

[0011]为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：[0012]一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：[0013]S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；

3

CN 108949915 A[0014]

说　明　书

2/8页

S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互识别；

[0015]S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；[0016]S4：引入硫黄素T，诱导产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；[0017]S5：记录荧光发光情况。

[0018]作为本发明一个优选的实施方法中，所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。[0019]作为本发明一个优选的实施方法中，所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。[0020]作为本发明一个优选的实施方法中，上述S3和S4中，还需加入Mg2+、dNTP和缓冲液，并置于恒温条件下扩增。

[0021]作为本发明一个优选的实施方法中，所述恒温的温度为45-65℃，扩增时间为15-30min。

[0022]作为本发明一个优选的实施方法中，上述S5中，每隔30s读取一次荧光并记录，所述记录方式为，对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。[0023]作为本发明一个优选的实施方法中，上述S2中的待测样品的浓度为2～8μM，所述DNA分子机器的浓度为1～120nM，将待测样品与DNA分子机器混合均匀，得到混合溶液。步骤S3中将所述缓冲液10～40μL、聚合酶6～10μL、切口酶6～10μL和dTP3～10μL加入S2中的混合溶液中参与反应，得到反应液；步骤S4中将所述硫黄素T 6～10μL、金属阳离子6～36μL加入到反应液中产生荧光反应。

[0024]作为本发明一个优选的实施方法中，所述dNTP浓度为0.12～0.50mM；所述聚合酶浓度为0.112～0.236U/uL；所述切口酶的浓度为0.01～0.06U/uL；所述硫黄素T的的浓度为0.1～70uM；所述缓冲液包括浓度为30～70mM，PH8.3～9.0的Tris·HCL、浓度为0.1％～0.6％的tween20、浓度为130～160mM的KCl、浓度为10～60mM的(NH4)2SO4和浓度为30～70mM的NaCL。所述金属离子的浓度为1～9mM。

[0025]作为本发明一个优选的实施方法中，所述待测样品的前处理步骤包括：剪取100mg植物待测病叶叶片，将待测病叶病叶的叶片置于液研钵中研磨得到组织材料，将所述组织材料固液分离得到植物组织材料，即所需的待测样品。[0026]本发明方法中，所述靶序列识别区的序列包括：5’-GTCTTGTCTTCC-3'。[0027]本发明方法中，所述切口酶识别区域序列为5’-…GACTC…-3’；所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；G-四链体合成模板为5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC…-3’。[0028](三)有益效果

[0029]本发明的有益效果是：

[0030]1.本发明可将疑似含有镰刀菌DNA的小麦待测样品中的核酸信号转化为G-四链体，在常温恒温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。[0031]2.相对于背景技术中所公开的专利技术，本发明所提供的DNA分子机器，序列简单，在聚合酶和切口酶的作用下，就可实现待测核酸信号的转化和扩增，步骤简单，灵敏性更强。

4

CN 108949915 A[0032]

说　明　书

3/8页

3.本发明可构建一种新型传感器构建出灵敏度高且不需要有荧光探针标记的新

型传感器，用于快速检测镰刀菌DNA。

[0033]4.本发明荧光信号可在简易手持设备(如手持紫外灯管/电筒)的帮助下肉眼观察确定，适用于多种快速核酸测定的场合。特异性强，在恒温、单个管中即可进行，无需使用价格昂贵或体积庞大的精密温控设备，便于进行现场的快速检测和分析。[0034]5.本发明G-四链体分子机器，用于将样品中的核酸信号转化为G-四链体，在等温或常温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫磺素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定，相对于现有技术的恒温扩增技术，减少荧光探针标记的处理步骤，在样品的定性检测上灵敏度更高，使用更方便，成本更低。附图说明

[0035]图1为线形DNA分子机器结构示意图；[0036]图2为环形DNA分子机器结构示意图；

[0037]图3为实施例1不同DNA分子机器的荧光强度测定曲线图；

[0038]图4为实施例2中不同浓度的硫黄素T的荧光强度测定曲线图；[0039]图5为实施例3中不同放置时间的荧光强度测定曲线图；

[0040]图6为实施例4中不同浓度的DNA分子机器和待测序列浓度的荧光强度测定曲线图。

具体实施方式

[0041]为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

[0042]一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；[0043]S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互识别；[0044]S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；[0045]S4：引入硫黄素T，诱导产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；[0046]S5：记录荧光发光情况。

[0047]本发明所选用的切口酶是一种只水解双链DNA中的一条链，在dsDNA上形成“单链缺口”的限制性切口酶，所形成的缺口通常在3端带有羟基，5端带有磷酸根，可以作为后续如置换型DNA合成、链置换扩增等反应的起始位点。切口酶Nt.BstNBI来源于重组大肠杆菌菌株，可应用于后续Vent(exo-)DNA聚合酶对DNA序列的等温扩增。

[0048]本发明中选用的G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四链体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四链体通过π-π堆积形成四链体。[0049]硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性荧光染料，自身荧光信号很低，但在单链、双链或三链DNA/RNA与G-四链体同时存在时，硫黄素T(ThioflavinT，ThT)能够区分不同的核酸类型，对G-四链体具有很强的结构选择性，与G-四链体结合并产生更加稳定的荧光。

5

CN 108949915 A[0050]

说　明　书

4/8页

进一步的，所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识

别区、稳定区和靶序列识别区。[0051]如图1和2所示，DNA分子机器可为线状或者环状。[0052]其中，所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。

[0053]由于本发明所检测的镰刀菌DNA序列较短，因此，所设计的DNA分子机器可将靶序列识别区设置在3’端，双链分子生成在双链形成的过程中，发生配位错位的概率较低，[0054]本发明具体实施时，镰刀菌DNA的序列特异性地与靶序列识别区域结合后，在聚合酶作用下延伸，并在切口酶识别区域形成双链，该双链结构能被切口酶特异性识别，并在其中一条链上产生切口，该切口的延伸方向继续以G-四链体合成模板为模板合成G-四链体序列，并被另一条相同生成方式的G-四链体序列剥离，自组装形成G-四链体结构，从而被特异性结合G-四链体结构的荧光分子结合，发出荧光。以空白测定做颜色对比，呈明显绿色荧光的，检测结果为阳性。[0055]进一步的，DNA分子机器，所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。[0056]进一步的，所述S3中，加入dNTP和缓冲液，并置于恒温条件下扩增；所述S4中，加入金属阳离子参与反应。其中，金属阳离子优选为Mg2+。[0057]所述恒温的温度为45-65℃，扩增时间为15-25min。[0058]进一步的，所述S5中，每30s读取一次荧光，并记录，所述记录方式为，对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。[0059]进一步的，所述S2中的待测样品的浓度为2～8μM，所述DNA分子机器的浓度为1～120nM，将待测样品与DNA分子机器混合均匀，得到混合溶液；[0060]进一步的，步骤S3中将所述缓冲液10～40μL、聚合酶6～10μL、切口酶6～10μL和dTP3～10μL加入S2中的混合溶液中参与反应，得到反应液；步骤S4中将所述硫黄素T6～10μL、金属阳离子6～36μL加入到反应液中产生荧光反应。[0061]进一步的，所述dNTP浓度为0.12～0.50mM；所述聚合酶浓度为0.112～0.236U/uL；所述切口酶的浓度为0.01～0.06U/uL；所述硫黄素T的的浓度为0.1～70uM；所述缓冲液包括浓度为30～70mM，PH8.3～9.0的Tris·HCL、浓度为0.1％～0.6％的tween20、浓度为130～160mM的KCl、浓度为10～60mM的(NH4)2SO4和浓度为30～70mM的NaCL。所述金属离子的浓度为1～9mM。

[0062]进一步的，所述待测样品的前处理步骤包括：剪取100mg植物病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中研磨得到组织材料，将所述组织材料固液分离得到植物组织材料，即所需的待测样品。

[0063]本发明方法中，所述靶序列识别区的序列包括：5’-GTCTTGTCTTCC-3'。[0064]进一步的，所述切口酶识别区域序列为5’-…GACTC…-3’；所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；G-四链体合成模板为5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC…-3’。[0065]其中，稳定区域优选设计为5’-TGCATC-3’或5’-TTTTTT-3’。

6

CN 108949915 A[0066]

说　明　书

5/8页

本发明实施例：

[0067]1.本发明实施例所使用的实验仪器和设备[0068]试验所使用到的仪器主要有：Thermo离心机，PCR仪(Thermo)，精宏恒温水浴锅，纯水仪(ELGA-purelab option)，移液枪，超净工作台，pH计(Mettler Toledo)紫外分光光度计(Thermo ND-1000V1.6)等。[0069]2试验试剂

[0070]硫黄素T(ThT)、硫酸镁(MgSO4)、双蒸水(DD H2O)、Isothermal Amplification BufferⅡ和NEB缓冲。[0071]3.切口酶、聚合酶

[0072]dNTP购自莱枫生物科技有限公司(上海)。[0073]NBstNBI切口酶购自NBI公司[0074]BstPol聚合酶购自生工公司[0075]实施例1

[0076]一种检测镰刀菌DNA的方法，具体的检测的步骤如下：[0077]步骤一：剪取100mg植物病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中，加入液氮中并研磨成粉末状；在室温下研磨带病毒的植物组织材料，直至汁液充分流出，并在离心机下离心得到植物组织汁液，置于93℃下加温30s后置于93℃下加温30s后作为待测样品溶液。[0078]步骤二：合成DNA分子机器，并配置成浓度为20nM的溶液，[0079]步骤三：取4μL的样品溶液与2μL的DNA分子机器溶液，微振荡混合均匀，得到混合溶液，

[0080]步骤四：依次分别将10μL的缓冲液、6μL聚合酶、6μL切口酶、6μL硫黄素T、6μLdNTP、6μLMg2+加入至步骤三所得到的混合溶液中，得到反应液。[0081]其中，上述dNTP浓度为0.12mM；聚合酶浓度为0.112U/uL；切口酶的浓度为0.01U/uL；硫黄素T的的浓度为0.1uM；缓冲液包括浓度为30mM，PH8.3的Tris·HCL、浓度为0.1％的tween20、浓度为130mM的KCl、浓度为10mM的(NH4)2SO4、浓度为30mM的NaCL；Mg2+的浓度为1mM。

[0082]步骤五：将反应液置于温度为45℃的恒温条件下，扩增15min。[0083]步骤六、对比溶液的颜色深浅，书面记录、拍照、录像或者测定吸收光谱。[0084]其中，将步骤一中的溶液替换为蒸馏水，其他条件相同做空白检测对比。[0085]应用本实施例方法进行检测时，将步骤一中的样品溶液替换为蒸馏水，其他条件相同做空白检测对比，样品检测结果与蒸馏水对照检测结果为，样品呈明显绿色荧光的，检测结果为阳性，即检测结果定性为含有病毒。[0086]实验结果：

[0087]本实验为验证DNA分子机器测定核酸的可行性以及最佳序列的选择，为更好的验证DNA分子机器，本实验将简单的镰刀菌DNA序列为5’-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3’作为待测核酸序列，并委托生工公司合成。

[0088]所验证的三条DNA分子机器序列分别为

[0089]G4M-1:5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTTTTTTGACTCGTCTTGTCTTCC-3’；[0090]G4M-2:5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATTCGACTCGTCTTGTC-3'；

7

CN 108949915 A[0091]

说　明　书

6/8页

G4M-3:5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATTCGACTCGTCTTGTCTTCC-3'。

[0092]在其他反应条件和试剂都相同的前提下，同时进行三组检测反应实验，检测结果，从而确定最合适地DNA分子生机器，并分别做空白试验，空白试验设计为待测的序列替换为纯水。

[0093]实验结果如图3所示，[0094]G4M-0：代表所加入的DNA分子机器为G4M-1，G4M-2，G4M-3，检测的样品为纯水的三条曲线，由于三条曲线差别微小，因此三条基本重合，在图3中显示为一条曲线，统一标记为G4M-0，

[0095]G4M1：代表所加入的DNA分子机器为G4M-1的荧光曲线，[0096]G4M2：代表所加入的DNA分子机器为G4M-2的荧光曲线，[0097]G4M3：代表所加入的DNA分子机器为G4M-3的荧光曲线。[0098]从图3可以看出加G4M-3组在490nm波长处波峰最高，其他各组波峰接近。上述结果表明目标序列可与G4M-3生成大量DNA结构，产生切口，富含G的核酸序列脱落生成G-四链体结构，G-四链体与ThT结合，使荧光强度显著增强，由此证明，G4M-3作为DNA分子机器检测核酸，可行性强。[0099]实施例2

[0100]一种检测镰刀菌DNA的方法，其中，所述DNA分子机器的序列为5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATTCGACTCGTCTTGTCTTCC-3’。[0101]具体的检测的步骤如下：[0102]步骤一：剪取100mg植物病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中，加入液氮中并研磨成粉末状；在室温下研磨带病毒的植物组织材料，直至汁液充分流出，并在离心机下离心得到植物组织汁液，置于93℃下加温30s后作为待测样品溶液。[0103]步骤二：合成DNA分子机器，并配置成浓度为60nM的溶液，[0104]步骤三：取8μL的样品溶液与4μL的DNA分子机器溶液，微振荡混合均匀，得到混合溶液；

[0105]步骤四：依次分别将40μL的缓冲液、10μL聚合酶、10μL切口酶、10μL硫黄素T、10μLdNTP、10μLMg2+加入步骤三的混合液中，混合均匀，得到反应液；[0106]其中，上述dNTP浓度为0.50mM；聚合酶浓度为0.236U/uL；切口酶的浓度为0.06U/uL；缓冲液包括浓度为70mM，PH9.0的Tris·HCL、浓度为0.6％的tween20、浓度为160mM的KCl、浓度为60mM的(NH4)2SO4、浓度为70mM的NaCL；Mg2+的浓度为6mM。[0107]步骤五、将反应液置于55℃温度下静置反应28分钟后观察荧光，记录检测结果，具体的是对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。[0108]应用本实施例方法进行检测时，将步骤一中的样品溶液替换为蒸馏水，其他条件相同做空白检测对比，样品检测结果与蒸馏水对照检测结果为，样品呈明显绿色荧光的，检测结果为阳性，即检测结果定性为含有镰刀菌DNA。[0109]实验结果：

[0110]本实验为优选本发明关键物质硫黄素ThT的最佳添加量，并验证其他反应体系在本实施例所述的添加量和浓度情况下，作为本发明方法检测核酸的可行性。[0111]其中，本实验中DNA分子机器设计为G4M-3(具体序列如实施例1所述)，其他反应条

8

CN 108949915 A

说　明　书

7/8页

件如实施例2所述，本实验将简单的miRNA序列CAATATTACTGTGCTGCTTTA作为待测核酸序列，并委托生工公司合成。

[0112]硫黄素T为单因素，浓度分别设计为0.1uM、1uM、5uM、10uM、20uM、40uM。每组检测之后，放置3小时之后进行荧光强度测定。[0113]如图4所示，在490nm处出现波峰，此时荧光强度最强。可以得出ThT浓度为20uM时波峰处荧光强度最大，且强度很高达到25000a.u以上，所以ThT的最佳的添加浓度为20uM，也可证明本实施例的方法具有测定核酸序列的较强可行性。[0114]实施例3

[0115]一种检测镰刀菌DNA的方法，其中，所述DNA分子机器的序列为5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATTCGACTCGTCTTGTCTTCC-3’。[0116]具体的检测的步骤如下：[0117]步骤一：剪取100mg植物病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中，加入液氮中并研磨成粉末状；在室温下研磨带病毒的植物组织材料，直至汁液充分流出，并在离心机下离心得到植物组织汁液，置于93℃下加温30s后作为待测样品溶液。[0118]步骤二：合成DNA分子机器，并配置成浓度为100nM的溶液，[0119]步骤三：取4μL的样品溶液与4μL的DNA分子机器溶液，微振荡混合均匀，得到混合溶液，

[0120]步骤四：依次分别将20μL的缓冲液、6μL聚合酶、7μL切口酶、10μL硫黄素T、3μLdNTP、36μLMg2+加入至步骤三所得到的混合溶液中，得到反应液。[0121]其中，上述dNTP浓度为0.3mM；聚合酶浓度为0.212U/uL；切口酶的浓度为0.03U/uL；硫黄素T的的浓度为0.1uM；缓冲液包括浓度为30mM，PH8.5的Tris·HCL、浓度为0.4％的tween20、浓度为145mM的KCl、浓度为45mM的(NH4)2SO4、浓度为46mM的NaCL；Mg2+的浓度为9mM。

[0122]步骤五、将反应液置于温度为56℃的恒温条件下，扩增30min。[0123]步骤六、对比溶液的颜色深浅，书面记录、拍照、录像或者测定吸收光谱。应用本实施例方法进行检测时，将步骤一中的溶液替换为蒸馏水，其他条件相同做空白检测对比，样品检测结果与蒸馏水对照检测结果为，样品呈明显绿色荧光的，检测结果为阳性，即检测结果定性为含有病毒。若通过荧光光谱测定来定性和定量，取出后在室温下放置一段时间，扫描在425nm激发波长下的荧光光谱，发射波长范围是455nm-695nm。[0124]实验结果：

[0125]本实验为验证本实施例的可行性，以及在反应结束之后，探索室温放置的时间长短对检测结果的影响。[0126]其中，本实验中DNA分子机器设计为G4M-3(具体序列如实施例1所述)，其他反应条件如实施例3所述，本实验将简单的作为待测核酸序列，并委托生工公司合成，在做实验时，将待测核酸序列配制成浓度为0.1uM的溶液替换为本实施例中的样品溶液，这是根据本实施例中2μM的样品溶液进行的估算。当反应结束后，取出在室温下放置不同时间(0h、1h、2h、18h)做四组单因素实验，分别扫描在425nm激发波长下的荧光光谱，发射波长范围是455nm-695nm。

[0127]实验结果如图5所示，比较不同放置时间做检测反应样品的荧光曲线，在1h、2h和

9

CN 108949915 A

说　明　书

8/8页

18h时反应样品荧光曲线波峰大幅度高于0h的波峰，因此，反应结束后，室温放置一定的时间可提高检测结果的灵敏度。18h的波峰高度微大于1h和2h的波峰高度，1h和2h的波峰高度差别可忽略不计，放置的时间过长对于检测结果的灵敏度不会产生更有效的影响，综上，检测反应之后，室温放置1h可显著提高结果的灵敏度，但放置的时间不因过长。[0128]实施例4：

[0129]一种检测镰刀菌DNA的方法，其中，所述DNA分子机器的序列为5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATTCGACTCGTCTTGTCTTCC-3’。[0130]具体的检测的步骤如下：[0131]步骤一：剪取100mg植物病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中，加入液氮中并研磨成粉末状；在室温下研磨带病毒的植物组织材料，直至汁液充分流出，并在离心机下离心得到植物组织汁液，置于93℃下加温30s后作为待测样品溶液。[0132]步骤二：合成DNA分子机器，[0133]步骤三：取4～8μL的样品溶液与2～4μL的DNA分子机器溶液，微振荡混合均匀，得到混合溶液，[0134]步骤四：依次分别将25μL的缓冲液、7μL聚合酶、9μL切口酶、6μL硫黄素T、8μLdNTP、30μLMg2+加入至步骤三所得到的混合溶液中，得到反应液。[0135]其中，上述dNTP浓度为0.26mM；聚合酶浓度为0.120U/uL；切口酶的浓度为0.02U/uL；硫黄素T的的浓度为0.1uM；缓冲液包括浓度为60mM，PH8.4的Tris·HCL、浓度为0.3％的tween20、浓度为150mM的KCl、浓度为45mM的(NH4)2SO4、浓度为66mM的NaCL；Mg2+的浓度为5mM。

[0136]步骤五、将反应液置于温度为48℃的恒温条件下，扩增18min。[0137]步骤六、对比溶液的颜色深浅，书面记录、拍照、录像或者测定吸收光谱。[0138]本实验为验证本实施例的可行性，和验证本发明的灵敏度。

[0139]本实验中DNA分子机器设计为G4M-3(具体序列如实施例1所述)，其他反应条件如实施例4所述，本实验将简单的miRNA序列CAATATTACTGTGCTGCTTTA作为待测核酸序列，并委托生工公司合成。

[0140]本实施例实验，在其他参数不变的情况下，以DNA分子机器的浓度和待测序列的浓度做双因素实验，其DNA分子机器的浓度浓度分别设置为10nM、50nM、100nM，待测序列的浓度分别设置为10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100pM、10pM、0，共设计24组实验，在波长490nm下分别测定每组测定结果的荧光强度，实验结果如图6所示，其中，横轴坐标表示待测序列的不同浓度，纵坐标表示荧光强度，每个折线图分别表示不同DNA分子机器浓度。[0141]从图6中可得，DNA分子机器浓度为50nM时，与待测序列曲线变化幅度大，灵敏度高。

[0142]应用本实施例方法进行检测时，将步骤一中的溶液替换为蒸馏水，其他条件相同做空白检测对比，样品检测结果与蒸馏水对照检测结果为，样品呈明显绿色荧光的，检测结果为阳性，即检测结果定性为含有病毒。

10

CN 108949915 A

说　明　书　附　图

1/3页

图1

图2

11

CN 108949915 A

说　明　书　附　图

2/3页

图3

图4

12

CN 108949915 A

说　明　书　附　图

3/3页

图5

图6

13