实验三 果酒酵母的分离
北方民族大学 实验方案
果酒酵母的分离、纯化及选育 果酒酵母发酵
院(部)名称：生物科学与工程学院 学生姓名：胡菲菲20092474 隆冬玲20092499 马忠孝20092526 张晶20092475 张静艳20092462 专业:生物工程 指导教师姓名:倪志婧
实验三果酒酵母的分离、纯化及选育 原始数据记录
1. 筛出5株酵母菌
2. 发酵力试验：采用CO2失重法
不同酵母菌株在发酵过程中CO2失重的动态变化 不同发酵时间（d）下三角瓶的重量/g
CO2释放
菌种1 菌种2 菌种3 菌种4 菌种5
156.1 155.22 152.86 151.02 149.95 149.28 148.15 7.95 155.1 153.97 152.04 150.34 149.42 148.66 147.7
7.4
158.4 156.73 154.78 152.99 152.1
151.24 150.04 8.36
152.5 151.83 150.85 149.38 148.34 147.32 145.94 6.56 164.8 163.82 161.51 159.43 158.24 157.25 155.49 9.31 原重
1d
2d
3d
4d
5d
6d
量
从上表可以看出1号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即1号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。 不同发酵时间（d）CO2释放量/g
菌种1 菌种2 菌种3 菌种4
1 0.98 0.67 1.67 1.13
2 2.31 0.98 1.95 1.93
3 2.08 1.47 1.79 1.7
4 1.19 1.04 0.89 0.92
5 0.99 1.02 0.86 0.76
6 1.76 1.38 1.2 0.96
菌种5
0.88 2.36 1.84 1.07 0.67 1.13
从上表可以看出1号和5号菌株在发酵开始时CO2释放量（g）最快，即1号和5号菌株发酵力最强。 3. 耐受性试验
做1号菌株和5号菌株的耐受性试验：采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8%、9%）二氧化硫（30、50、60、90、120mg/L）的耐性。 1号菌株
酒精量（%） 5 充满小 6 7 8 9 无气杜氏小管产气情况 管 二氧化硫浓度（mg/L） 半管 小气泡 无气体 体 30 充满小 50 充满 小管 60 90 120 无气杜氏小管产气情况 管 5号菌株
半管 小气泡 体
酒精量（%） 5 充满小 6 充满小 管 7 8 9 无气杜氏小管产气情况 管 二氧化硫浓度（mg/L） 半管 无气体 体 30 50 60 90 120 杜氏小管产气情况 充满小 充满小半管 小气泡 无气
管 管 体 从上表可以看出1号和5号菌株对二氧化硫耐受力基本相同，5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。
实验方案
果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化3-5株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。
一、实验目的和内容1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。 二、实验原理
酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。 三、实验仪器与材料 样品：苹果
YEPD培养基（富集培养基）:蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. PDA培养基（酿酒酵母培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000ml。121℃灭菌30分钟。）
器具：三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
四、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。 (1)．酵母菌的分离初筛
1）菌种采样
土壤
样品
瓜根际土壤 藤下方土壤 垄间隙土壤
用无菌剪刀剪取不
用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴
采集
好无菌手套取500g左右的土样装入无菌
方法
袋内。
装入无菌袋内。
期）分别装入
袋内。
无菌袋内。
段的叶片
膨大期，成熟
装入无菌
同生长阶
甜瓜（幼龄期，
烂的果实
用无菌剪刀摘
用无菌剪
取不同龄期的
刀摘取腐
叶片
果实（带柄）
腐果
随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。 2）富集培养与纯种分离
方法一：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。
方法二：将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养。待长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。 (2)．酵母菌种的复筛
选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。
培养24h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验：采用CO2失重法，取100mL三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液，在20℃下发酵。发酵过程中每24h测定1次CO2损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻，直到减轻量不高于0.2g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。
(3)．酵母菌的耐受性试验
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3次。
活化条件：28℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h 发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4d； 接种量：1×107cfu/mL。 1）耐酒精度试验
采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml，再以水果原汁为培养基，制成含酒精量为10%、12%、14%、16%、18%系列的液体培养基。
按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量： 试管编号 95%酒精/mL 果汁/mL
0 0 10
10 1.05 8.95 10
12 1.26 8.74 12
14 1.4 8.60 14
16 1.68 8.32 16
18 1.90 8.10 18
20 2.15 7.85 20
培养液含酒精%（v/v） 0 2）耐SO2试验
按亚硫酸含量为6%计，计算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐SO2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量： 试管编号 亚硫酸/uL 果汁/mL
培养液含SO2mg/L 五、技术指标
1．富集培养：指从微生物混合群开始，对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法
富集培养基：富集培养所采用的培养基为富集培养基
富集培养基的作用：使混合微生物中的特定种的数量比例不断增高，并引向纯培养。
0 0 10 0
1 10 10 60
2 17 10 100
3 20 10 120
4 30 10 180
5 40 10 240
2.酵母菌镜检：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。 3.血球计数板的使用 以计数酵母菌为例
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.
(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片.
(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.
(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中 计算公式
(1)16格×25格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数 (2)25格x16格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数 六、实验时间进程表
1.3月11日10:00-12:00
配制YEPD培养基（富集培养基），配制PAD培养基（酿酒酵母培养基） 将买来的苹果削皮，把果皮放到研钵捣碎，等待接种用 2.3月11日16:00-18:00
将配制好的YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适果皮各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天 将PDA培养基灭菌，倒平板 将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养 3.3月14日16:00-18:00
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。 腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养。
4.3月16日14:00-17:00
第一次纯化：挑取单个菌落镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养
将PDA培养基灭菌，倒平板待用 5.3月18日10:00-12:00 第二次纯化
配制PDA培养基，PYG培养基（菌种保藏培养基） 6.3月18日16:00-18:00 培养基、培养皿、试管灭菌
PDA培养基倒平板，PYG培养基倒斜面待用
7.3月19日10:00-12:00
观察酵母菌生长状况，镜检看是否已纯化 第三次纯化
8.3月20日10:00-10:30 观察平板上是否长菌，未长出 9.3月21日14:00-14:30
观察平板上是否长菌，未长出，老师建议明天再来看，可能是培养基有问题 10.3月22日14:00-15:00 第四次纯化
镜检无杂菌的接种倒斜面上，保藏菌种2株 11.3月23日14:00-16:00
镜检无杂菌的接种倒斜面上，保藏菌种3株 开始进行复筛前准备 12.3月25日10:00-12:00 发酵力试验：采用CO2失重法
制作酵母种子液：将配制好的YEPD培养基分装于5个100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后将斜面上的5株菌分别接种到三角瓶中，120r/min，28℃摇床培养2天 13.3月27日14:00-19:00 稀释酵母种子液为2.67×108个/ml
配制PAD培养基（发酵培养基），分装于5个100ml三角瓶内每瓶80ml高温灭菌冷却，然后，将酵母种子液（2ml）对应接种到发酵培养基，称重，28℃恒温培养。
酵母菌的耐受性试验：采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8%、
9%）二氧化硫（30、60、60、90、120mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的PDA培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况 14.3月28日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 15.3月29日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 16．3月30日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 17.3月31日14:00-17:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 重复做一次酵母菌的耐受性试验 18.4月1日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 19.4月2日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 20.4月3日14:00-14:30
称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象 21.4月4日14:00-14:30 称取发酵培养基的重量，记录数据 观察酵母菌的耐受性试验现象。
实验四果酒酵母发酵 原始数据记录
1.果浆1.2L 2.果浆中总糖含量
第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次
式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果应表示至一位小数。
第一次测得果浆中糖的含量为10g/L，1.2L果浆中含糖12g，向果浆中加糖316g，最后到
F（g） 0.0625 0.0625 0.0625 0.0625 0.0625 0.0625 G（g/ml） V（ml） 0.0025 0.0025 0.0025 0.0025 0.0025 0.0025 23 23 23.5 22.6 24.2 24.8 V1（ml） V2（ml） V3（ml） X(g/L) 1 1 1 1 1 1 20 50 50 30 50 50 1 1 1 1 1 1 10 250 187.5 130 50 25 25g/L 测定酒度 3.果浆中酸的含量
式中：X——样品中滴定酸的含量，g/L；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——吸取样品的体积，mL；S苹果酸＝0.067
第一次测得果浆中酸的含量为1.57g/L，向果浆中加入苹果酸4.43g
第三次 第四次 第五次 第六次 第七次 0.65 1.64 0.63 0.81 0.61 0.05 0.12 0.05 0.10 0.05 1 2 1 1 1 4.02 4.取100ml果汁加50ml蒸馏
5.09 水，蒸馏得100ml液体，29oC
3.89 下，测得酒精度7.5o，根据酒精
4.76 度温度校正表得，20oC下，果
4.20 汁的酒精度8o
第一次 第二次 V1（ml） V0（ml） V2（ml） X（g/L） 0.57 0.50 0.10 0.09 2 1 1.57 2.75 实验方案
选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。 一、实验目的和内容
1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2．用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿
果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。
二、实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：
果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。 三、实验仪器与材料 样品：新鲜水果及压榨汁。
试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土； 器皿：三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5×1.2cm）冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。 四、实验方法与步骤
1．自选酵母发酵性性能的检测试验：用筛选菌种发酵果酒 （1）果酒酿造的工艺流程
鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处
理→调配→过滤→成品 （2）工艺简述 1）发酵前的处理
前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。
①破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
②二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。（以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：[葡萄果实×70%×60]/[0.06×1000]。）此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。
2）果汁的调整：取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。
①糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整：酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。 3）酒精发酵
发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，
然后加入3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。残糖降为0.4%以下时主发酵结束。然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒窑，在12-28℃下放置1个月左右。发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁相同。 4）成品调配
果酒的调配主要有勾兑和调整。勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。勾兑，一般先选一种质量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。调整，主要有酒精含量、糖、酸等指标。酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配，也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，用同品种的浓缩汁效果最好，也可用砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。 5）过滤、杀菌、装瓶
过滤有硅藻土过滤、薄板过滤、微孔薄膜过滤等。果酒常用玻璃瓶包装。装瓶时，空瓶用2-4％的碱液在50℃以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀菌。果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还应进行杀菌。 （3）发酵性能测定
测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。 还原糖、总糖的测定：直接滴定法。 总酸的测定：中和滴定法。 酒度的测定：蒸馏法。 酒度的测定
1.实验目的和内容
1）采用酒精计法测定葡萄酒(果酒)中酒精度。2）适用于各种类型葡萄酒(果酒)中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%(v/v)，保留一位小数。
2.实验原理以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20℃时乙醇的体积百分数，即酒精度。 3.实验材料全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。 4.操作步骤
1）用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温20℃）于500mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL
2）将试样倒入洁净、干燥的100mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。所得结果表示至一位小数 五、技术指标
1.总糖和还原糖的测定（一）──费林试剂比色法
1.1实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。 1.2实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O（砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。 1.3实验材料和用具 1）试剂
费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。 费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100gNaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。 2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。 1.4操作步骤
1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。 2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比预备试验少1mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。 计算
式中：F——费林溶液A、B各5mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。
3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2～0.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（4）计算。
4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总
糖量为0.2～0.4g，加5mL盐酸溶液，加水至20mL，摇匀。于68±1℃水浴上水解15min，取出，冷却。用200g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）。调温至20℃，加水定容至刻度（V2）。吸取费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。
式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果应表示至一位小数。 1.5注意事项
1）本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2＋量固定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2＋，得到错误的结果。
2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。
4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。
5）样品溶液应预测，其目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在10ml左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml左右样液在继续滴定时加入，以保证在1分钟之内完成继续滴定工作，提高测定的准确度。
6）必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热原一般采用800W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。
2.滴定酸的测定—中和滴定法
2.1实验目的和内容
1）采用中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。以g/L报告其结果，测定值保留一位小数。
2.2实验原理利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。
2.3试剂酚酞指示剂溶液，10g/L：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L。 1）配制
将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。 2）标定
称取0.6g于105～110℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001g。溶于50mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。 3）计算
按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C＝m/(V1-V2)×0.2042
式中：C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；m——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。 2.4操作步骤 1）样品的测定
取调温至20℃的样品2.00-5.00mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。 2）空白的测定
吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。
3）结果计算
按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：
式中：X——样品中滴定酸的含量，g/L；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——吸取样品的体积，mL；Si——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045 六、实验时间进程表 1.3月30日14:30-17:00
买苹果，制苹果浆，配制测定糖和酸的试剂 2.3月31日14:30-17:00
测定果浆的糖量和酸量，根据发酵需要调整糖度和酸度 活化菌种，将菌种接种到果浆中，28℃恒温发酵。 3.4月1日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 4.4月2日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 5.4月3日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 6.4月4日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 7.4月5日14:30-15:30
测定发酵果浆的糖量和酸量 8.4月6日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 9.4月7日14:30-15:30 测定发酵果浆的糖量和酸量 10.4月8日14:00-16:00 用纱布过滤出果汁，测定其酒精度
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容