维普资讯 http://www.cqvip.com 、 弘／渤， 农业新技术新方法译丛 １９９３№２（总４９） 番茄花粉活力的测定法 Ａ Ａｒｅｆ Ａ－等 潍 嗜 ｆ 提要 介绍一种测定番茄花粉活力的方法。用生长培养基培养花粉．该培养基（ｐＨ５．２）含有０．２９ Ｍ 蔗糖，Ｉ．２７ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．１６ｍＭ Ｈ３ＢＯ３和Ｉ ｍＭ ＫＮＯ３．另加０．００１％荧光素二乙酸酯（ＦＤＡ）。能 在３０分钟内测出每份样品中荧光花粉所占百分率来估评花粉活力。该法还能在９ｏ分钟内测出离体花粉 的萌发率和花粉管生长情况。萌发介质和ＦＤＡ对花粉萌发和花粉管生长均无任何不利影响．荧光花粉 粒所占百分率与花粉萌发率高度相关．表明荧光性质是确定花粉活力的优良表征。荧光性一萌发率综合法 简单易行，适于常规筛选大量样品。 开发可靠地测定花粉功能质量的方法， 要的时间（约１．５小时）比活体法所需时问 对于鉴定不同环境条件下发育的花粉质量 少，适合常规筛选大量样品，但该法在预测 和制定杂交计划十分重要．常用来鉴定花 花粉萌发方面的潜力主要取决于萌发培养 粉质量的方法有３种：活体或离体花粉萌发 基和温度的优化程度以及供试样品中有无 法、花粉管生长法、组织化学法。 适宜的花粉数量和质量（Ｈｅｓｌｏｐ－－－ 活体花粉萌发法是将花粉授到去雄后 Ｈａｒｒｉｓｏｎ等，１９８４）。 的柱头上，过一定时问将花柱放在载玻片上 组织化学法是根据花粉粒营养细胞特 用盖玻片压碎观测花粉管数量（Ａｂｄａｌｌａ和 定成分的染色能力或专化酶的活力进行测 Ｖｅｒｋｅｒｋ， １９６８；Ｄｅｍｐｓｅｙ， ｌ９７０；ｖａｎ 定。碘化钾用于淀粉染色（Ｃｈａｒｌｅｓ和 Ｋｏｏｔ和ｖａｎ Ｒｏｖｅｓｔｉｊｉｎ，ｌ：９６３）：，或者测葬 ＨａｒｒｉＳ，１９７２），苯胺蓝用于淀粉和其他多 成熟果实中的、种子数（Ｅ１ Ａｈｍａｄｉ和 糖物质染色（Ｄｅｍｐｓｅｙ＇，１９６２；Ｄｉｏｎｎｅ和 Ｓｔｅｖｅｎｓ， ｌ ９７９； ＭｃＧｕｉｒｅ， ｌ ９５２； Ｓｐｉｃｅｒ，１９５８），焰红一甲基绿（ｐｈｙｌｏｘｉｎ－ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ和Ｐｈｉｌｏｕｚｅ，ｌ９８２）．这些 ｍｅｔｈｙｌｇｒｅｅｎ）用于细胞壁染色（Ｗｅａｖｅｒ和 方法需要花费大量时间，因而对于测定大量 Ｔｉｍｍ，ｌ９８９；Ｗｅａｖｅｒ等，ｌ９８５），藏红和 样品是不实用的。况且，结实不仅取决于受 醋酸洋红用于染色质和核糖核酸染色 精作用，还取决于授粉后子房的发育，雌蕊 （Ｄｉｎｎｅ和Ｓｐｉｃｅｒ， ｌ９５８； Ｒｕｄｉｃｈ等， 的受精力及不亲和性反应（Ｂｅｒｒｙ和 １９７７）。酶的活力常通过四唑基还原产生难 Ｕｄｄｉｎ， １９８８；Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ等， 溶性有色甲稽（Ｃｏｏｋ和Ｓｔａｎｌｅｙ，１９６０）和 １９８４）． 荧光素二乙酸酯（ＦＤＡ），由酯酶水解产生 离体花粉萌发法是使化粉在人工培养 荧光紊（Ｒｏｔｍａｎ和Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ，１９６６）来 基上萌芽，然后测定萌发力和花粉管生长情 测定． ， 况（Ａｂｄａｌｌａ和Ｖｅｒｋｅｒｋ，ｌ９６８；Ｃｈａｒｌｅｓ和 组织化学法测定花粉活力需要时问短 Ｈａｒｒｉｓ，ｌ９７２；Ｈｏｗｌｅｔｔ，ｌ９３６；Ｌｅｖｙ等， （２０—３０分钟），更适合常规筛选大量样品， １９７８；Ｗｅａｖｅｒ和Ｔｉｍｍ，１９８９）。该法需 但染色培养基对花粉往往产生不利影响而 ２５— 维普资讯 http://www.cqvip.com 干扰其活力．这种情况可以部分她说明以 前有些研究将组织化学试验数据与离体萌 发测定花粉质量相比发现所得结果不一致 的原因（Ｃａｈ ｅｒｒ，１９６４、．因此，组织化学 法的根本要求是染色培养基和萌发培养基 ２Ｏ℃下贮存；另取８份在６℃下贮存。贮前 （贮藏时间为零）测定两份样品的活力。每 种温度下贮存的样品均定贮存ｌ，２，５， ｌＯ天后取样两份测定活力 活力测定根据两种标准：！）有ＦＤＡ 必须对萌发力和花粉管生长无不利影响． 本研究的目的是将ＦＤＡ与离体培养 法相结合，开发出一种快速而可靠地鉴定花 粉活力的方法，先测定ＦＤＡ水解产生的荧 时的荧光性和．。２）离体萌发率测定Ｏ．３ ｍｇ 花粉样品的活力．将花粉样品放在盛有 １．４ ｍｌ新配ＭＳ培养基的３５ ｍｍ培养皿中 萌发．该生长培养基（没有琼脂的液体培 养）含０．２９ Ｍ蔗糖，１．２７ ｍＭ Ｃａ（ＮＯ１），、 光现象，后测定样品的萌发力，在短时问内 次操作就能鉴定花粉活力。 材料和方法 花粉来源１９９０年４月一７月，在昼／ 夜温度为３２／２６±３℃的温室栽ｌ６株番茄 品系ＣＬ ｌｌ３ｌ ＨＤ＿－４３－８－１．在最佳昼／ 夜温度为２５／２２±３℃的温室内另栽ｌ６株 品种Ｌｏｎｇ Ｋｅｅｐｅｒ和品系ＣＬ ｌｌ３１．－ｃ卜 ｏ＿ｌ３＿＿０—６苗．所有操作管理均与温室番 茄生产的相同．第一个品系的花粉用于确 定荧光形成和萌发过程所需时间，对同一样 品既用荧光也用离体培养来确定花粉活力 测定的最佳条件．第二个品系和品种 。Ｌｏｎｇ Ｋｅｅｐｅｒ 的花粉在６℃或２５℃下贮 存ｌ，２，５，ｌＯ天后测定其活力． 制备花粉样品 预备试验选用的花粉 样品是从同一植株上长势相等的第ｌ（最下 位），２，３花序上的花朵内采集．．下文介绍 的花粉活力测定均从植株最下部３个花序 上的花朵内采集花粉．每隔一天采集花朵 带回实验室在室温下保存ｌ小时，然后将 ３ｏ朵（贮存试验用７Ｏ朵）花放在３５ ｍｍ平 皿内用机械振动器振动花药５秒钟采集花 粉．花粉混匀后分成数份，每份０．３ ｍｇ，分 别用作一次测定的样品．采集花朵后４小 时内完成荧光和萌发试验．为了测定贮存 温度和时间对花粉活力的影响，每个品系或 品种均取８份花粉样品（每份０．３ ｍｇ）在 ２６— Ｏ．１６ ｍＭ Ｈ３ＢＯ３和ｌ ｍＭ ＫＮＯ３（ｐＨ５．２） 的用作对照试验，另加０．００１％ＦＤＡ的用 作荧光处理，在２７℃下保温到指定时问． 测定离体萌发率是用Ｄｉａｐｈｏｔ－ＴＭＤ型倒 置显微镜在卤灯光源下观察，计算正常萌发 率和总萌发率（包括不正常萌发）．当花粉 粒的花粉管等于或长于该花粉粒直径时即 视为萌发．有ＦＤＡ时的荧光性测定是在 水银灯产生的紫外线光源下计算荧光花粉 粒的百分率．其原理是有活力花粉粒的营 养细胞吸收无荧光的ＦＤＡ后，ＦＤＡ被酯 酶水解释放荧光素就在紫外线下发出荧光 （激发波长＝４８５ ｎｍ，吸收波长＝５２０ ｉｒｍ）， 无活力的细胞则不能水解ＦＤＡ，因而不能 发出荧光（Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ等，１９７０， １９８４；Ｒｏｔｍａｎｄ等，１９６６）．每次测定花粉 粒ｌＯｏｏ—ｌ２ｏｏ个，在装有供试样品的培养 皿内一系列纵横交叉线上检测８一ｌＯ个 点。进行变量分析确定总萌发百分数与荧 光西分数之问是否有差异．分析按品种、温 度、类型（萌发与荧光）及贮藏期的２×２×２ ×５阶乘进行． 结果与讨论 对照样品活力与ＦＤＡ培养基中样品 活力比较结果如图ｌ（略）．培养１２０分钟 后对照样品的花粉活力以正常萌发百分率 和总百分率（不正常及正常萌发的花粉粒） ｒ 维普资讯 http://www.cqvip.com 表示，ＦＤＡ处理的样品花粉活力以荧光花 襄ｌ花粉在６℃和２５℃下贮存后的荧光率和 粉粒所占百分率表示．有些花粉粒放在培 总萌发搴 养基内２５分钟左右花粉管开始伸长，但正 常的花粉粒在９ｏ分钟后萌发率达到高峰 （１８％）．此时，总萌发率为３８％，但样品中 有些不正常的花粉粒还在萌发，因而总萌发 率仍略有升高．在ＦＤＡ处理的样品中，花 粉粒放到培养基上２—４分钟后开始出现荧 光．全部活花粉粒（包括完整的不正常花粉 粒）均能发出荧光，２ｏ－－３Ｏ分钟内有３５— ３８％花粉粒发出荧光，３Ｏ分钟后，不正常花 粉粒的荧光开始消失．这种情况可能是由 于花粉粒中的荧光索浸析到培养基中，失活 的不正常花粉粒继续水解ＦＤＡ造成的． 这种假设可以解释３Ｏ分钟后荧光百分率稍 微下降的原因．上述结果表明，３Ｏ分钟时 ＦＤＡ处理样品的荧光率达到高峰（３８％）， 相当于对照样品９Ｏ分钟时的总萌发率 （３８％）． 在离体培养中，２０－－３０分钟内的荧光 花粉百分率与９Ｏ分钟时花粉萌发率无显著 ｚ同一样品在含有０．００１％ＦＤＡ的培养基中２Ｏ一３Ｏ分钟 内的荧光率和９０分钟时的萌发率． 差异（表ｌ，２）．同样，活力试验与其他因 Ｙ两次测定的平均致 素（温度、贮存期）之间也无显著的相互影 响．超过贮藏时间，花粉活力显著下降，贮 襄２襄ｌ所列数据的方差分析 存温度为６℃时比２５℃好．鉴定番茄花粉 活力的ＦＤＡ法与离体萌发方法之间的相 关性高度显著（ｒ＝０．９７，Ｐ＜０，００Ｉ），与 Ｈｃｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ（１ ９７０）以及Ｈｅｓｌｏｐ－－ Ｈａｒｒｉｓｏｎ等（１９８４）所得结果一致．然而， ● 他们的显微荧光测定法最根本的要求是花 粉粒细胞膜的完整性，而且要测定单粒花粉 的荧光，还有培养基淋溶荧光索的问题．这· 种显微测定法要求每份样品测定几百粒花 粉的荧光，甚费时间．再者，测定计数过程 拖延紫外光照射时间，因而荧光强度及活力 都减弱．Ｈｃｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ等（１９８４）所用 培养基的蔗糖含量高，缺少硼，ＦＤＡ浓度 为本试验的４ｏ倍． ··显著水平为Ｐ＝Ｏ．０５ ２７— 维普资讯 http://www.cqvip.com 花粉粒在添加ＦＤＡ的培养基中培养， 在３Ｏ分钟内测定样品中的荧光花粉粒所占 百分率来鉴定花粉活力，是一种简 可靠的 方法，适于常规筛选大量样品。无论是生长 培养基还是ＦＤＡ（在供试浓度下）对花粉 萌发和花粉管生长均无任何不利影响（图 ２，略）．在预备试验中还对４种染色剂（酚 藏花红、间苯二酚蓝、台盼蓝、氯化三苯基四 唑（锚））进行估价。证明以往所介绍的染色 浓度，严重伤害花粉粒细胞而抑制蛸发。 借助ＦＤＡ测定花粉活力有两个缺点： 第一，有些非荧光的花粉粒几乎与背景一样 黑暗，不易鉴别，样品中非荧光花粉粒往往 视为荧光花粉粒，致使荧光花粉粒计数偏 高；第二，正常和不正常的活花粉粒都有荧 光，因而不能鉴别哪些荧光讫粉粒能正常萌 发，哪些不能正常萌发。第一个缺点容易克 服，可将样品放在ＵＶ和低强度的卤灯光 下观察鉴定．在双重光照下，有荧光的花粉 粒为黄色荧光故能鉴别，无荧光的花粉粒清 晰可见．但要分辨某样品中哪些荧光花粉 （上接第ｌｌ页） 表５列示根际和非根际土 壤的ＡＴＰ含量及以此值为基础计算｝｛｜来 的生物量Ｃ和Ｎ ＡＴＰ含量与生物量Ｎ （表３）一样；根际、非根际及非根域土壤都 是有机肥连用区的最多，其次足化肥连用 区，不施肥区的最少，明显看出施肥管理的 差异。根际土壤的ＡＴＰ含量也比非根际 及非根域土壤的多，与生物量Ｎ一样有明 显的根际效应（表４）。这种根际效应在各 处理区之间是不施肥区的人。 用Ｊｅｎｋｌｎｓｏｎ等（１９７９）的生物量 Ｃ／ＡＴＰ比值ｌ３８，由本试验所得ＡＴＰ含 量计算所得生物量Ｃ，与Ｈａｓｅｂｃ等（１９８４） 用氯仿薰蒸法测定长期施肥稻ｆＴｊ落水期土 壤所得生物量Ｃ差异不大。Ｌｕｒｉａ（１９６０） 假定微生物的生物量Ｃ／Ｎ比为６，用此比 值计算出生物量Ｎ，与本试验测定得到的 ２８一 粒能正常萌发哪些不能 常萌发，需要把萌 发时问延长到９Ｏ分钟后在卤灯光源下检 查。存这些条件下，细胞膜损伤的及不正常 （例啦ＩＪ有两个花粉管）的花粉粒很容易与能 正常萌发的完整花粉粒区别，损伤的或不正 常的花粉粒最终将其内禽物释放到培养基 中而皱缩和失去荧光。 在胁迫条件下，畸形花粉粒增多，冈此 建议培养９０分钟存双重光照射下测定之 后，再过３Ｏ分钟第二次测定荧光率以便获 得有关萌发花粉完整性和畸形频率的资 料． 、 在ＭＳ生长培养基中加入ＦＤＡ来鉴 定花粉活力，是一种 陕速而可靠的方法：用 该法能存３Ｏ分钟内凭其荧光率和９Ｏ分钟 后实际的离体萌发率测ｌＩ｜化粉活力。 （参考文献２４篇，略）’ 张善勇译陈世勇校 译自 ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．》 １ ９９２，№３，４７３—４７６ 生物量Ｎ进行比较．结果表明，在有机肥 连用区的根际和非根际土壤中，这两种生物 量Ｎ非常一致；但不施肥 及化肥连用区， 由ＡＴＰ含量计算ｆＩ｛来的数随则较低。由 此可见，这两种生物量Ｎ的数值之问呈现 棚当良好的对应关系 但荇想得出淹水期 稻ｎ１土壤生物量Ｎ的更准确数值，由ＡＴＰ 含量问接计算，倒不如用本文介绍的直接提 取土壤Ｎ进行测定的方法更为精确，而且 比ＡＴｖ法在操作上更为简单，这就是本法 的优点． （参考文献８篇，略） 林淑娟译陈世勇校 译ｃｊ《Ｈ本士壤肥料学杂志》 １９９２，№３ ３ｌＯ一３Ｉ３ 、 ． ●