交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用

毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良

【摘 要】目的：探讨交叉引物扩增技术（CPA）快速检测系统在结核病诊断中的价值。方法收集唐山市第四医院2015年3～5月206例结核病就诊患者的痰液标本，其中肺结核患者95例（其中痰涂片阳性26例，阴性69例），非结核患者111例，分别采用RT‐PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法（RT‐PCR）检测标本中的结核分枝杆菌，对结果进行统计分析。结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT ® TB‐CPA 法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27．37％（26／95）、50．53％（48／95）、56．84％（54／95）、51．58％（49／95）。以罗氏培养结果为诊断金标准，EasyNAT ® TB‐CPA 法灵敏度为89．58％（43／48），特异度94．94％（150／158）；RT‐PCR法的灵敏度为83．33％（40／48），特异度94．30％（149／158）；EasyNAT ® TB‐CPA与 RT‐PCR法相比，总体一致性为98．54％（203／206）， Kappa指数值为0．92。结论 TB‐CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值，且方法简便、快速。 【期刊名称】《检验医学与临床》 【年(卷),期】2016(013)008 【总页数】3页(P1107-1109)

【关键词】结核分枝杆菌;恒温扩增;培养法;交叉引物扩增技术 【作 者】毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良

【作者单位】河北省唐山市第四医院 063001;河北省唐山市第四医院 063001;华北理工大学附属医院，河北唐山 063009;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市滦南县医院 063500 【正文语种】中 文

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球最具威胁的传染病之一。据世界卫生组织统计，我国患结核病人数居世界第2位，是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制定和治疗效果评估的重要依据。目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法，包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养[2]。涂片检查简便、易行，但阳性检查率较低[3-4]；分离培养法是目前结核病诊断的金标准，具有很高的灵敏度，但至少需要3～8周的时间，但耗时较长，不能满足结核病早期诊断的要求。随着分子生物学的发展，近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[2]。然而，以基因序列为基础的快速诊断方法虽然快速、敏感，但仪器、设备和试剂比较昂贵。交叉引物扩增技术(CPA)是一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[5-6]。CPA是将核酸扩增反应的全过程均在同一温度(63±2)℃下进行，不需要像实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)那样经历几十个温度变化的循环过程。CPA方法简单，设备要求低，可通过一次性肉眼判读结果，且保持了核酸扩增快速、高灵敏度的特点，适合在基层医院推广使用。本研究将CPA法与传统痰涂片镜检法、罗氏培养法和RT-PCR法痰标本中结核分枝杆菌的检测进行临床应用评价，以期满足临床诊断的需求。

1.1 一般资料 连续收集唐山市第四医院结核病专科门诊2015年3～5月初诊疑似者肺结核患者痰标本。纳入标准：(1)咳嗽咳痰超过2周因呼吸道症状接受检查的初诊可疑结核病患者；(2)同意留取合格的痰标本并进行检测；(3)痰标本量≥2

mL。就诊患者依照肺结核临床诊断流程参考文献[7]。排除标准：(1)随访的结核病患者；(2)不签署知情同意的结核病患者；(3)已经使用抗结核药物治疗大约2周的患者；(4)试验过程中，因技术性因素造成结果缺失者。最终纳入206例患者，年龄16～70岁，平均(35.0±15.6)岁，男86例，女40例。经临床诊断的结核病患者182例，其他肺部疾病患者24例。

1.2 仪器与试剂 萋-尼染色试剂(抗酸染色液)由本实验室自己配置；罗氏培养基为外购杭州加伟生物技术有限公司；RT-PCR试剂外购自A厂家(生产批号20150112)；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增试纸条法)由杭州优思达生物技术有限公司生产(批号20150116)；MK-10E干式恒温金属浴为杭州奥盛仪器有限公司生产；PRC仪器为ABI7500荧光PCR仪。EasyNAT® 核酸提取试剂(注射器法)由杭州优思达生物技术有限公司生产(批号20150124)。 1.3 方法

1.3.1 痰涂片和培养 将收集的痰标本进行荧光法涂片镜检，痰标本的收集和涂片镜检按照《痰涂片镜检质量保证手册》进行操作。荧光染色后镜检，剩余标本依照痰液黏稠程度加入2～3倍4% NaOH，每次均设置空白对照[8]。37 ℃温箱培养，每周观察并及时记录结果。培养阳性的菌株采用硝基苯甲酸(PNB)培养基法进行分枝杆菌鉴定。

1.3.2 EasyNAT® TB-CPA法检测 分别检测国家结核病参比实验室提供的结核核酸参考品(S1～S4)，结核分枝杆菌浓度(/mL)分别为103、102、10、1[9]。采用杭州优思达生物技术有限公司生产的EasyNAT®核酸提取试剂(注射器法)对结核分枝杆菌进行DNA的提取；按照EasyNAT® TB-CPA操作说明进行操作，15 min后读取结果并记录试验结果[10]。结果判读：若检测T线和质控C线同时出现或检测T线显色时，判读为阳性；若只有质控C线出现时，判定为阴性；若质控线，检测T线都未出现时，结果为无效。查找原因，可能是扩增抑制，导致失

败；或试剂盒损坏导致失败。

1.3.3 RT-PCR法检测 按照厂家试剂说明书操作，使用ABI7500进行扩增和检测，并记录试验结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析，4种方法阳性检出率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；EasyNAT® TB-CPA与RT-PCR检测结果一致性分析采用Kappa指数法，Kappa值越大，说明结果一致性越高。Kappa质在0.4～0.7，提示吻合程度一般，大于0.7，说明吻合较好。

2.1 4种方法的阳性检出率比较 在纳入的206例初诊患者中，95例初诊肺结核患者结果见表1。结核患者中，涂片法、罗氏培养法、EasyNAT® TB-CPA法、RT-PCR法的阳性检出率分别为27.37%(26/95)、50.53%(48/95)、

56.84%(54/95)、51.58%(49/95)。其中，EasyNAT® TB-CPA的检出率最高，其次为RT-PCR法和罗氏培养法。

2.2 不同方法诊断效能比较 在纳入的206例初诊患者中，以罗氏培养法及生化鉴定结果为金标准，涂片法灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为47.92%、98.10%、88.46%、113.92%，EasyNAT® TB-CPA法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.58%、94.94%、84.31%、98.10%，RT-PCR法检测结核分枝杆菌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为83.33%、94.30%、81.63%、99.37%。不同方法检测结果灵敏度、特异度比较见表2。以罗氏培养法及生化鉴定结果为金标准，涂片法、EasyNAT® TB-CPA法和RT-PCR的一致性Kappa指数分别为0.83、0.77、0.54，其中EasyNAT® TB-CPA法和RT-PCR法与罗氏培养法结果吻合度较高。EasyNAT® TB-CPA法与RT-PCR法结果的总体一致性为98.54%(203/206)，Kappa指数值为0.92，具有很高的一致性。对罗氏培养法结果为阳性的48株病原菌进行PNB培养基法鉴定，均为结核分枝杆菌。

目前，结核病的诊断主要依据涂片、培养，其中痰培养是肺结核诊断的金标准，但由于痰培养周期较长，一般需要3～8周，且易污染，后期需要配合菌种鉴定做出诊断。常规涂片法阳性率较低，容易漏诊。所以结核病的早期诊断，对于控制结核病的传播具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，近年来涌现出很多方法可用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定。结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增试纸条法)采用CPA技术，利用2对特异度引物、1对促进引物、1对特异度性探针及Best DNA聚合酶，实现恒温[(63±2)℃]完成核酸的扩增和杂交过程，然后在密闭的一次性核酸检测装置中利用免疫层析乳胶标记试纸条检测技术，完成扩增产物的检测。一次性的核酸检测装置可以减少或避免扩增产物气溶胶造成的污染和假阳性[11-12]。

为了验证EasyNAT® TB-CPA法检测临床痰标本的灵敏度和特异度，本研究验分别采用痰涂片法、罗氏培养法、EasyNAT® TB-CPA法和RT-PCR法对206例临床初诊疑似肺结核患者的痰标本进行检测。结果显示，结核患者中，涂片法、罗氏培养法、EasyNAT® TB-CPA法、RT-PCR法的阳性检出率分别为27.37%(26/95)、50.53%(48/95)、56.84%(54/95)、51.58%(49/95)。EasyNAT® TB-CPA法的阳性检出率明显高于涂片法，与常规罗氏培养法基本一致。以罗氏培养法为金标准，EasyNAT® TB-CPA法的灵敏度为89.58%，特异度为94.94%，两种方法的一致性为0.83，具有较高的一致性。RT-PCR法的灵敏度为83.33%，特异度为94.30%。EasyNAT® TB-CPA法与RT-PCR法在检测肺结核患者中，具有较高的一致性(Kappa指数为0.92)，与参考文献[13]结果一致。RT-PCR法已经在临床诊断结核上广泛应用，其结果可以作为肺阴结核的诊断指标之一，检测时间为3～4 h，但需要价格昂贵的荧光PCR仪器，对实验室条件、操作人员的技术均要求很高，限制了其在基层医院的应用[14]。EasyNAT® TB-CPA法检测结核分枝杆菌具有较高的灵敏度和特异度，可以在2 h内完成检测并出具报

告，而且结果判读容易，通过肉眼观察是否有显色条带即可，对实验室操作人员能力要求较低、试剂可以常温运输等特点。因此，EasyNAT® TB-CPA法非常适用于各级综合医院、专科医院和小型机县级医院开展结核分枝杆菌的检测新技术。

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