一） 蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）
蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（ Lowry 法）和 紫外吸收法、考马斯亮蓝法。 其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高， 比紫外吸 收法灵敏 10~20 倍，比双缩脲法灵敏 100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往 以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 在选择方法时应该考虑：（1） 实验测定要求的灵敏度和精确度; （2）蛋白质的性质;（3）溶液中存在的干扰物 质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林 酚法（ Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵 敏度最高， 比紫外吸收法灵敏 10~20倍，比双缩脲法灵敏 100倍以上。 定氮法较 复杂，但准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 在选择 方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度; （2）蛋白质的性质;（3） 溶液中存在的干扰物质; （4）测定花费时间。
1 微量凯氏定氮法（ GB 5009.5-2010）
1.1 原理 样品与浓硫酸共热。 含氮有机物即分解产生氨（消化） ，氨又与硫酸作
用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此 酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
1.2 操作方法 样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤
1.3特点 准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为^2%;操作复杂费时，整 个过程
需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和 非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。
2 双缩脲比色法
2.1 原理 双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋 白质含
有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与 Cu形成 紫红色络合物，在一定的实验条件下， 未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应， 并于
2+
540~560nm 测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白 质浓度。其
颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质的分子量及氨基酸成 分无关。
22操作方法标准蛋白溶液或样液直接加双缩脲试剂反应
先绘制标准曲线，再测定样品
30min，即可测定。
2.3特点 灵敏度低1〜20mg , 20~30分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单
一；测定结果与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关； 灵敏度不高，约为1mg，双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白 质测定。
3 福林酚法（ Lowry 法）
3.1原理 蛋白质在碱性溶液中其肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此
复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下， 利用蓝色深浅 与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在
750nm 有最大吸收峰。
3.2操作方法 测定依次加福林酚甲液、乙液后可见光度计 750nm测定；先绘制 标准
曲线、再测定样品。
3.3特点 试剂配制略麻烦，但试剂可长期保存；测定灵敏度高，约 5mg ，测定
时间约 40〜60 分钟，操作简便；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 测定结果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响） 。
4 紫外吸收法
4.1 原理 蛋白质分子中， 酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，
使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度（即光密度 值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量 成正比。 利用一定波长下， 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系， 可 以进行蛋白质含量的测定。
4.2操作方法 直接上紫外分光光度计测定，需绘制标准曲线
4.3特点 灵敏度 50〜100mg ， 5〜10分钟完成，操作十分简便，但结果受样
品蛋白品种影响大。
5 考马斯亮蓝法
5.1 原理 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定 律 ，
因此可以通过测定染料在 595nm 处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质 量。
5.2操作方法 直接加考马斯亮蓝试剂反应 5min 后即可测定；先绘制标准曲线， 再测
定样品。
5.3特点 灵敏度高，约为1〜5mg （比Lowry法灵敏4倍），测定时间5〜15
分钟，操作简便、迅速、干扰物质少、 重线性好， 但要求样品颜色为无色或浅色， 灵敏度高。
二）蛋白含量的测定方法及步骤
1 微量凯氏定氮法（ GB 5009.5-2010） 1.1 试剂 硫酸铜、硫酸钾、硫酸、 2%硼酸溶液、混合指示液（ 1 份 0.1%甲基红乙醇溶液
与5份 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；或 2份0.1%甲基红乙醇溶液与 1份 0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合） 、40%氢氧化钠溶液、 0.1mol/L 盐酸标准溶 液。
1.2 仪器 消化架、吸量管、量筒、微量滴定装置、锥形瓶、容量瓶、定氮蒸馏装置 1.3 分析步骤： 1.3.1 消化
精密称取固体样品 0.2~2g,半固态2~5g，液体样品10~20mL （约相当于
30~40mg 氮）于干燥洁净的凯氏烧瓶，加入 6g 无水 K2SO4， 0.2g CuSO4， 20mL H2SO4。瓶口放一小漏斗，先小火加热待泡沫停止后加大火（330~400C）,直到
溶液澄清透明，再继续加热0.5h~1h。冷却后加水定容100mL （数次冲洗，使样 品溶液全部移入容量瓶）
1.3.2 蒸馏
将 2%硼酸溶液 10mL 放入 100mL 三角瓶中（接收瓶），加入甲基红混和指 示剂 2~3 滴，此时为紫红色， 将冷凝管尖端浸入液面下。 蒸馏装置中的水蒸气发 生器装水 2/3，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持 水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
准确吸取2.0 mL〜10.0 mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以 10 mL水 洗涤小玻杯并使之流入反应室内， 随后塞紧棒状玻塞。 将 10.0 mL 氢氧化钠溶液 倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室， 立即将玻塞盖紧， 并加水于小玻杯 以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏 10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离 开冷凝管下端，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液 接收瓶。
1.3.3 滴定
馏出液用标准 HCl 溶液滴定，直到蓝绿色变为淡紫色。并将滴定结果用空 白试验校正。
1.3.4 计算：
蛋白质(%) = (Vi-V2)x CX 0.0140X FX 100/m V3X 100%
Vi—样品滴定时消耗的标准HCI溶液体积（mL）
V2—空白滴定时消耗的标准HCI溶液体积（mL） C—标准HCI溶液的摩尔浓度（moI/L ）
0.0140— 1mL 1moI/IL HCI 相当于 0.0140g 氮 F —氮换算成蛋白质的系数，一般食物为 6.25 m—试样的质量（g）
V3—测定时吸取消化液的体积（mL） 2 双缩脲法 2.1 试剂
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配
制成10mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280nm为0.66来校正 其纯度。 如有需要， 标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量， 计 算出其纯度， 再根据其纯度， 称量配制成标准蛋白质溶液。 牛血清清蛋白用 H2O 或0.9% NaCI配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称取 1.50g硫酸铜（CuSO4.5H2O ）和6.0g酒石酸钾钠
（KNaC4H4O6.4H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10% NaOH溶液, 用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。 若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.2 器材
可见光分光光度计、试管 1 5支、旋涡混合器等。
2.3操作方法 2.3.1标准曲线的测定：取 7支试管，分别加入 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8，1.0mL 的10mg/mL标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩
脲试剂。
充分摇匀后，在室温(20~25°C)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。 用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。 以蛋白质的含量为横坐标，光
3 福林酚法(Lowry法)
3.1试剂 3.1.1试剂甲：50份A与1份B混合，即为试剂甲
A 液：10g Na2CO3, 2g NaOH 和 0.25g 酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6.4H2O)。溶解
于500 mL蒸馏水中。
B液：0.5g硫酸铜(CuSO4?5H2O)溶解于100mL蒸馏水中。 3.1.2试剂乙:
在2 L磨口回流瓶中，加入 100g钨酸钠(Na2WO4?2HfeO), 25g钼酸钠 (Na2MoO4?2H2O)及 700 mL 蒸馏水，再加 50 mL85%磷酸，100 mL 浓盐酸， 充分混合，接上回流管，以小火回流 10小时，回流结束时，加入150g硫酸锂 (Li2SO4), 50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15分钟，以便驱除过量 的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤) 。稀释至
1L,过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH滴定，酚酞作指
示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。
3.1.3标准蛋白质溶液（250他/mL）:精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水 再定
容。
3.2仪器
可见光分光光度计、旋涡混合器、秒表、试管
3.3分析步骤
3.3.1标准曲线的测定：取7支大试管，分别加入0，0.1, 0.2，0.4，0.6, 0.8, 1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250 pg/mL）。用水补足到
1.0毫升，然后每支
试管加入5mL试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（ 分
钟。再逐管加入0.5 mL试剂乙，同样立即混匀。这一步混合速20〜25C）放置10
度要快，否则
会使显色程度减弱。然后在室温下放置 10分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试 管作为空白对照，于750nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质浓度为横
4紫外吸收法 4.1分析步骤 4.1.1绘制标准曲线
取八只试管分别加入 0 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml、3.0 ml、 4mL的1mg/mL牛血清蛋白标准溶液，加水至 4 mL，在280nm条件下测定其吸 光值
图3紫外法测定蛋白质标准曲线
5考马斯亮蓝法 5.1试剂 5.1.1 1mg/mL牛血清蛋白标准储备液：精密称取0.1g牛血清蛋白标准品用蒸馏 水定容于100mL容量瓶。
5.1.2 100卩g/m.牛血清蛋白标准工作液液：取 10mL牛血清蛋白标准储备液加
水定容至100mL
5.1.3考马斯亮蓝试剂：取0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入 lOOmL质量浓度为0.85 g/mL的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到lOOOmL。 5.2仪器和设备
试管、移液管、移液枪、可见分光光度计
5.3分析步骤 5.3.1标准曲线的绘制
取六只试管分别加入 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL的浓 度为100 jg/ mL牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0 mL。然后每只试管加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min,在紫外-可见分光光度计595nm处
测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的浓度（卩g/mL）为横坐 标绘制标准曲线。
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