法医学杂志 ２０１３年６月 第２９卷 第３期 ・２０９・ 改良ＴＲＩｚｏｌ法同步提取血液ＲＮＡ和ＤＮＡ 秦娟娟 ，路志勇 ，焦章平 。朱晓君 ，王颖希 ，唐晖 （１．山西医科大学基础医学院法医学系，山西太原０３０００１；２．北京市公安局刑侦总队，北京１００１９２） 摘 要：目的建立一种应用ＴＲＩｚｏｌ试剂针对同一生物检材在提取总ＲＮＡ的同时又能提取ＤＮＡ的新方 法。 方法使用传统ＴＲＩｚｏｌ法将含有总ＲＮＡ的水相移除，调节中间层和有机相的ｐＨ值，乙醇沉淀ＤＮＡ， 运用ＤＮＡ ＩＱＴＭ ｓｙｓｔｅｍ试剂盒纯化ＤＮＡ 检测ＤＮＡ纯度和质量浓度，并以之为模板进行ＰＣＲ—ＳＴＲ分型。 与传统ＴＲＩｚ０１法提取的基因组ＤＮＡ进行比较。 结果改良ＴＲＩｚｏｌ法提取的基因组ＤＮＡ较传统ＴＲＩｚｏｌ法 提取的基因组ＤＮＡ纯度和质量浓度高，扩增后ＳＴＲ分型良好。 结论改良ＴＲＩｚｏｌ法可靠易行，能够实现 同一样本同时提取ＲＮＡ和ＤＮＡ的目的，可以满足法庭科学个体识别和亲缘鉴定的要求。 关键词：法医遗传学；提取法：ＴＲＩｚｏｌ法；血液 中图分类号：ＤＦ７９５．２ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００４—５６１９．２０１３．０３．０１４ 文章编号：１００４—５６１９ｆ２０１３）０３—０２０９—０３ Ｍｏｄｉｉｆｅｄ ＴＲＩｚｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｃｏ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ ＱＩＮ Ｊｕａｎ－ｊｌ“ ．ＬＵ Ｚｈｉ－ｙｏｎｇ２，ＪＩａ０ Ｚｈａｎｇ－ｐｉｎｇ２，ｚＨＵ Ｘｉａｏ－ｊｕｌｆ．ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｘｉＩ，ＴＡＮＧ Ｈｕｉ２ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂ Ｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｘ Ｍｅｄｉｃｏｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ Ｄ３ＤＤＤ ， Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｒｉｍｉｎａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｔｅａｍ，Ｂｅｏ＇ｉｎｇ Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ｂｕｒｅａｕ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ＣＯ．ｅｘ仃ａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓａｍ— ｐｉｅ ｂｙ ＴＲｌｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＴＲＩＺＯ１ ｍｅｔｈｏｄ．ｔｈｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｐＨ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ａｄｊｕｓｔｅｄ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｗａｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｗｉｍ ＤＮＡ ＩＯ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ＤＮＡ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｙｔ．Ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ．ｉｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ａｎｄ ｔｙｐｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．ＳＴＲ．Ｔｈｅ ｄａｔａ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＴＲＩＺＯｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｉｔｓ Ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｑｕａｌｉｙｔ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｙｔ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａ ｇｏｏｄ ＳＴＲ ｔｙｐｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＴＲｌｚｏ１ ｍｅｔｈｏｄ ｉＳ ａｄｖｉｓａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅ． ｏｕｓｌｙ ｅｘｔｒａｃｔ ｂｏｃｈ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓａｍｐｌｅ．Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｅｍｉｙｔ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｓａｒｉｓｆｙ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｏｆ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＴＲＩｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ；ｂｌｏｏｄ ＴＲＩｚｏｌ试剂是当前从细胞或组织中提取总ＲＮＡ 的同时又能制备较高纯度和质量浓度基因组ＤＮＡ， 的常用试剂，最大的特点就是可同时分离一个样品中 且经该法处理后的样本可以用现有常规实验室方法 的ＲＮＡ、ＤＮＡ和蛋白质。使用ＴＲＩｚｏｌ法同时提取法 进行后续实验，同时进行手工与自动化提取。 医检材中的ＲＮＡ和ＤＮＡ进行个体识别和体液鉴别． 已经成为目前法医学实验室研究的热点之一 但是． １材料与方法 在提取总ＲＮＡ之后，仅依照ＴＲＩｚｏｌ试剂盒说明书的 １．１样本 操作步骤，利用剩余的中间层和有机相提取ＤＮＡ，操 收集健康成人血液２００ ＩｘＬ，分别取１０ Ｌ涂抹于 作时间长（约为３ｈ），且其中的苯酚、蛋白质污染会影 ２０个ＦＴＡ卡上阴干后，室温储存。１０份用于传统 响后续实验的效果，不利于该法的推广。本研究对 ＴＲＩｚｏｌ法，１０份用于改良ＴＲＩｚｏｌ法。 ＴＲＩｚｏｌ法加以改进，使之在同一检材中提取总ＲＮＡ １．２仪器与试剂 小型台式离心机、大型冷冻离心机、ＮａｎｏＤｒｏｐ￣ 基金项目：北京市科技计划资助项目（ｚ１ｌ１１０００５６８１１０２４） ＮＤ一１０００微量紫外可见分光光度计（美国Ｔｈｅｒｍｏ 作者简介：秦娟娟（１９８７～），女，山西临汾人，硕士研究生，主 Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司），７５００实时荧光定量ＰＣＲ系统、 要从事法医ＤＮＡ研究；Ｅ～ｍａｉｌ：５９４５７０２７９＠ｑｑ．ｃｏｒｎ ９７００型扩增仪、３１３０ＸＬ遗传分析仪（美国ＡＢ公司）。 通信作者：唐晖，女，主任法医师，主要从事法医ＤＮＡ检验和 ＴＲＩｚｏｌ￣试剂盒、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＭＴ ＩＩＩ Ｒ ｒ，Ｐｌａｔｉｎｕｍ￣ 研究；Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｉｈｕｉｔａｎｇｎｏ１＠１６３．ｔｏｍ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＭＩＸ试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生 ・２１０・ 命技术公司），ＤＮＡ ＩＱＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司）， ＩｄｅｎｔｉｉｆｌｅｒＭＴ试剂盒（美国ＡＢ公司），枸橼酸钠，无水 乙醇，氯仿，氢氧化钠（ＮａＯＨ）。 １．３方法 １．３．１ ＲＮＡ和ＤＮＡ的提取 ＲＮＡ和ＤＮＡ的提取分别采用传统ＴＲＩｚｏｌ法和 改良ＴＲＩｚｏｌ法进行。 传统ＴＲＩｚｏｌ法：剪取１ ｃｍ ＦＹＡ血卡放人１．５ｍＬ 的微量离心管中，加入１ ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ，振荡５ ｍｉｎ，然后 加入２００ Ｌ氯仿剧烈振荡１５ Ｓ，放置３ ａｒｉｎ后，４℃下 １２０００ｘｇ离心１５ ｍｉｎ，吸取上层水相液体按照ＴＲＩｚｏｌ 说明书的操作步骤提取ＲＮＡ。在去除上层水相后的 中间层和有机相中加入３００ Ｌ冷无水乙醇混匀，室 温放置３ｒａｉｎ，４ ｏＣ下，２０００ｘｇ离心５ｒａｉｎ，沉淀ＤＮＡ。 然后用０．１ ｍｏｌ／Ｌ枸橼酸钠溶液（含ｌ０％乙醇）１ ｍＬ 洗涤ＤＮＡ沉淀，室温放置３０ｍｉｎ，重复３次，最后用 １．５ｍＬ ７５％乙醇溶液洗涤，室温放置２０ｍｉｎ，重复３次。 空气中干燥ＤＮＡ沉淀约１５ ｍｉｎ．用８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液４０ Ｌ溶解ＤＮＡ沉淀，用１０ Ｌ ＴＥ调节ＤＮＡ沉 淀至ｐＨ约为８．４，４ 下保存备检。 改良ＴＲＩｚｏｌ法：ＲＮＡ的提取同传统ＴＲＩｚｏｌ法。在 去除水相后的中间层和有机相中加入５ ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＯＨ １０ Ｌ立即混匀，室温放置３ｍｉｎ后加入３００ Ｌ 冷无水乙醇混匀，室温放置３ ａｒｉｎ，室温下，１２ ０００ｘｇ， 离心５ｒａｉｎ，沉淀ＤＮＡ，加入２００ Ｌ裂解缓冲液后采 用ＤＮＡ ＩＱＴＭ ｓｙｓｔｅｍ试剂盒进行纯化。 分别取以上方法提取的ＤＮＡ １ ＩｘＬ．使用Ｎａｎｏ． Ｄｒｏｐ￣ＮＤ一１０００微量紫外可见分光光度计测定ＤＮＡ 的Ｄ２６０和Ｄ１堋，根据Ｄ 与Ｄ２８０的比值确定提取ＤＮＡ 的纯度 每份样本的纯度和质量浓度均重复测量３次，取 平均值。用ＳＰＳＳ １３．０统计软件对两种方法提取的 ＤＮＡ纯度和质量浓度分别进行比较。 ｌ－３．２扩增和检测 以上提取的ＲＮＡ按照ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＭＴ ＩＩＩ ＲＴ／Ｐｌａｔｉ ｈｕｍ￣Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＭＩＸ试剂盒说明，使用 文献ｆ１１中的引物序列扩增管家基因１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ （ＴＡＭＲＡ荧光标记）和外周血特异性遗传标记ＳＰＴＢ （ＦＡＭ荧光标记）。 提取的ＤＮＡ均用ＩｄｅｎｔｉｉｆｌｅｒＭＴ试剂盒进行扩增． ３１３０ＸＬ遗传分析仪检测。ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ ｖ３．２软件 对数据结果进行分析。 ２结 果 两种方法提取的ＤＮＡ纯度和质量浓度，差异均 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｎｅ ２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３ 有统计学意义（表１，Ｐ＜０．０５）。传统ＴＲＩｚｏ｜法与改良 ＴＲＩｚｏｌ法提取ＤＮＡ的ＳＴＲ分型图谱分别见图１ ２。 采用以上方法提取的ＲＮＡ，经管家基因１８Ｓ、ＧＡＰＤＨ 和外周血特异性遗传标记ＳＰＴＢ检测．均成功得到相 应的目的产物 表１两种方法提取ＤＮＡ的纯度和质量浓度比较 （ｎ＝１０， ） ， 兰兰二二 二二二 竺！二二二 二二＿二 。Ｌ————————— ——————————－｛ ———————————— ———————４＿ 三 三三 竺三三 三 鑫 ； ＝ ＝ … 厂——————～—广一１ ————一 ］ Ｌ— —— ｛————４———— —— ０ ＝＝ 。。。。＿。 １００ ２∞ 厂— —————————————————————————一一—］ Ｉ ２００ｔ； Ｌ善—— —毒———————每————————＿一 图１传统ＴＲＩｚｏ１法提取ＤＮＡ的ＳＴＲ分型 。 竺兰三三三二二二竺 ［三三＝ 三二三３ 竺兰三三 ： 鲢 。船— 一 三三三三 三 二 ！三一＿ 兰三二三 Ｌ——荽——专．＝＿——毒—— 毒—— — 衄 ＝＝ ＝＝＝＝＝＝＝４ ｌＱｏ ￣０ ３９ｏ 『删 ＩＬ— ——４ ——— ｒ Ｉ—— ：＝＝＝ ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝。。。＝＝＝＝＝＝ 。。。。 ｌ ２ １ ８００厂— —————一——～～———］ ４ ．６一～—喜一——— 图２改良ＴＲＩｚｏｌ法提取ＤＮＡ的ＳＴＲ分型 ３讨论 ＤＮＡ在法医学个体识别和亲子鉴定中发挥着 重要作用，但ＤＮＡ只具有种属特异性而没有组织特 异性．不能判断法医检材的组织来源，而ｍＲＮＡ和 ｍｉｃｒｏＲＮＡ具有组织特异性圜，成为目前法医学体液鉴 别的热点。ＴＲＩｚｏｌ试剂内含苯酚、异硫氰酸胍等物质， 能迅速破碎细胞．抑制细胞释放核酸酶，并且能够同 时分离样品的ＲＮＡ和ＤＮＡ。然而，目前常用的ＴＲＩｚｏｌ 法只对总ＲＮＡ的分离效果较好，提取的ＤＮＡ纯度和 质量浓度并不理想。本研究采用了一种便捷、高效的 改良ＴＲＩｚｏｌ法提取基因组ＤＮＡ，充分利用实验材料， 尽可能多地保留检材中的遗传信息，从而可以满足利 用少量生物检材同时确定检材类型和ＳＴＲ分型，具 有实际应用价值。 ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ和ＤＮＡ的原理是利用ＲＮＡ 和ＤＮＡ的等电点不同，ＲＮＡ为２～２．５，ＤＮＡ为４～４．５， 因此ＲＮＡ和ＤＮＡ的溶解度受ｐＨ值的调节。在酸性 法医学杂志 ２０１３年６月 第２９卷 第３期 ・２１１． 酚中抽提时。水相回收ＲＮＡ。然后用乙醇对处于酚相 和酚相一水相界面的ＤＮＡ进行沉淀，再用８ ｍｍｏｌ／Ｌ 年来，Ｂｏｗｄｅｎ等［４１使用ＤＮＡ ＩＱＴＭ ｓｙｓｔｅｍ和Ｍｉｎｉ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉ０ｎ Ｋｉｔ Ⅱ两个试剂盒相结合的方法从同一份 样本中成功分离ＲＮＡ和ＤＮＡ，为法医学实验室通过 应用少量检材来同时确定检材类型和ＳＴＲ分型的广 泛应用提供了基础。改良ＴＲｌｚｏｌ法作为一种可以同 时满足手工与自动化提取同一检材中总ＲＮＡ和ＤＮＡ ＮａＯＨ进行溶解。根据碱性环境中ＤＮＡ水溶性高的 特点。改良ＴＲＩｚｏｌ法提前将分离水相后的剩余溶液 ｐＨ值调至碱性，以促进ＤＮＡ在含乙醇的有机溶剂中 充分沉淀。由于ＤＮＡ在ｐＨ值为５－９的环境中稳定， 在ｐＨ＞７．８的有机溶液中处于析出状态，当ｐＨ＞１２会 的新方法，可以得到良好的ＲＮＡ和ＤＮＡ的ＳＴＲ分 型结果，并且能大大缩短操作时间。 本研究所建立的方法操作简便、快速有效，且与 现有常用ＤＮＡ提取平台有机结合．较传统ＴＲＩｚｏｌ法 更适用于实际案件检验，为法医学实验室充分利用少 引起双链之间的氢键断裂，因此剩余溶液ｐＨ值不宜 过高。本法在剩余液中加入５ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ １０ Ｌ 调节其ｐＨ一８，使剩余液的酸碱度达到最佳沉淀条 件。此外．Ｎａ 的加入也会促进ＤＮＡ的沉淀，而钠盐在 后续的步骤中洗脱。 ＤＮＡ ＩＱＴＭ法是目前法医学实验室最广泛使用的 ＤＮＡ提取方法，与其他提取方法比较．提取的ＤＮＡ纯 量检材来同时确定检材类型和ＳＴＲ分型提供了一种 可靠易行的实验方法。 参考文献： ［１］Ｈａａｓ Ｃ，Ｋｌｅｓｓｅｒ Ｂ，Ｍａａｋｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．ｍＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌ— ｉｎｇ ｆｏｒ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄ ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ—ｆ 度较好且得率最高例。改良ＴＲＩｚｏｌ法将ＤＮＡ ＩＱＴＭ法和 传统ＴＲＩｚｏｌ法相结合，所提取ＤＮＡ的纯度和质量浓 度均高于传统ＴＲＩｚｏｌ法。ＮａＯＨ溶液的加入使提取的 ＤＮＡ易溶于ＴＥ缓冲液或洗脱缓冲液中，可以在一２０℃ 长期保存，免去了传统ＴＲＩｚｏｌ法使用８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶解后又要加入ＴＥ缓冲液或ＨＥＰＥＳ缓冲液调节 ｐＨ值至８－４才可进行ＰＣＲ，或调节ｐＨ值至７～８并加 入１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液才可以长期保存的繁琐步骤。 在法庭科学中，提取人类基因组ＤＮＡ的主要目的 ｔｉｏｎ ｅｎｄｐｏｉｎｔ ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ Ｇｅｎｅｔ，２００９，３（２）：８Ｏ一８８． ［２］Ｂａｕｅｒ Ｍ．ＲＮＡ ｉｎ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ Ｇｅｎｅｔ，２００７，１（１）：６９－７４． ［３】畅晶晶，张素华，李莉．全血中ＤＮＡ ６种提取方法的 比较［Ｊ］．法医学杂志，２００９，２５（２）：１０９—１１１，ｌ１４． 【４］Ｂｏｗｄｅｎ Ａ，Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｒ，Ｈａｒｂｉｓｏｎ Ｓ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ＣＯ—ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌｌｓｅ ｏｎ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓａｍｐｌｅｓ 是用于ＳＴＲ遗传标记的分型检测，达到个体识别或亲 子鉴定的目的，而通过对现场检材ＲＮＡ的分析来进 行组织来源的判定，对案件的性质判定具有重要的价 值，能够使法医物证检材在法庭中更具有说服力。近 ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＩＱ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，５（１）：６４．６８． （收稿日期：２０１２—０７—１３） （本文编辑：李成涛） 《法医学杂志》常用主题词（三）