铜肽PLGA纳米粒子对黑素细胞黑色素合成作用的研究

０１９年３月２０１９Ｍａｒ．）　２ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉａｏｎｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ　　　　　ｇｙ（　（）１０００７３５２０１９０１０８８５１００　　文章编号：－－－：／ＯＩ１０．１１６７９ｌｓｘｂｌｋ２０１９０１００８８　　Ｄ

铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞黑色素合成作用的研究赵春晖，　张褚新

）（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁大连　１１６０８１

）摘　要：铜肽（是甘氨酰组氨酰赖氨酸三肽与铜的络合物，具有多种生物活性．ＣＧＨＫ－ｕ以乳酸－乙醇酸共聚物（为载药材料制备铜肽Ｐ并研究其对黑素ＰＬＧＡ）ＬＧＡ纳米粒子，细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的作用．实验结果表明：铜肽对蘑菇酪氨酸酶具有激活作用；粒径大小为１在透射电ＰＬＧＡ纳米粒子中铜肽的包封率为４０．１２％，００～２００ｎｍ，镜下为大小均匀的圆形粒子．铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子可以将铜肽成功导入黑色素细胞内，激活酪氨酸酶的活性并增加黑色素的含量．研究结果为研究铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对色素减退或色素脱失性皮肤病的治疗作用提供了初步的实验依据．关键词：铜肽；黑素细胞；黑色素合成ＰＬＧＡ纳米粒子；中图分类号：Ｑ５９９　　　文献标识码：Ａ

，铜肽是甘氨酰组氨酰赖氨酸三肽与铜结合的化合物，英文缩写为ＧＨＫ－其水溶液呈蓝色，所Ｃｕ

［］以又称为“蓝铜”．ＧＨＫ是１９７３年由Ｐｉｃｋａｒｔ等首先从人血浆中分离得到的一种三肽１．ＧＨＫ和二

（）价铜离子有很强的亲和力，能自发地与其形成络合物ＧＨＫ－图１其功能主Ｃｕ．根据目前的研究结果，要包括：有效促进胶原蛋白的产生，增加血管生长和抗氧化能力，并刺激葡糖胺聚糖产生，帮助皮肤恢复自我修补的能力；促使上皮细胞的生长和分化，从而加快创面的愈合；作为组织重塑的激活剂，还可促使神经细胞、免疫相关细胞和肾小球细胞的生长、分裂和分化，刺激表皮干细胞增殖标记物、整合素、６３的产生２－４．ｐ

，）乳酸－乙醇酸共聚物［是一种由欧美药监局批准的合成高分子ＰｌｃｃｏｌｌａｃｔｉｄｅｏｏｌｉｄｅＬＧＡ］－－ｇｙｐｙ（），医药用辅料（图２纳米粒子具有延长药物作作为缓释给药系统的基体材料被广泛研究．ＰＬＧＡ微球、用时间、降低药物毒性和刺激性等特点，这主要基于其优异的生物相容性、可调控的生物降解性等优

５］点．纳米粒子作为蛋白质、酶类药物、基因、疫苗等的载体是研究的热点［．ＰＬＧＡ微球、

［

］

广泛存在于微生物、动植物及人体中．在植物中，酪氨酸酶是一种７５ｋＤ的含铜金属氧化还原酶，酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶；在昆虫中，一般称为酚氧化酶；在微生物和人体中，称为酪氨酸酶．酪氨酸酶是黑色素代谢过程中的关键酶，具有单酚酶活性和二酚酶的活性，能将酪氨酸羟化成Ｌ－３，４－二（，，二酚酶活性）羟基苯甲酸（单酚酶活性）然后将Ｌ－多巴醌Ｌ－多巴）３，４－二羟基苯甲酸氧化成多巴醌（

６］经一系列反应后，形成黑色素［广泛分．黑色素主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞制造产生，

布在人的眼睛、头发和皮肤等组织中，具有保护皮肤免受紫外线照射伤害和清除有毒药物和化学残留

７］的作用，在人体中发挥着重要的作用［可能会诱发色素减退或色素脱失性皮肤病，．如人黑色素异常，

２０００１８８９　　收稿日期：－－，：女，辽宁大连人，赵春晖（辽宁师范大学副教授，博士．作者简介：９７４Ｅ－ｍａｉｌｚｃｈｌｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ１＠－）

第１期赵春晖等：ＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞黑色素合成作用的研究　铜肽Ｐ８９　

８］

如黄褐斑、白癜风等［并研究其对黑素细胞黑色素合．本研究拟将ＧＨＫ－Ｃｕ制备成ＰＬＧＡ纳米粒子，

成的作用．

图１　铜肽ＧＨＫ－Ｃｕ的化学结构

图２　ＰＬＧＡ结构式

ｉ．１　ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＨＫ－ＣｕＦ　　ｇ

ｉ．２　ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰＬＧＡＦ　　ｇ

１　材料与方法

１．１　材料

，主要仪器设备：激光粒度仪（全自动酶标仪（英国ＭＭＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００，ａｌｖｉｎ公司）ｕｌｔｉｓｃａｎＡｓ－　　，，，透射电子显微镜（日本Ｈ超声细胞破碎仪（美国ＴＳｃｅｎｔｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）ｉｔａｃｈｉ公司）ｃｉｎｅｔｚ－　宁波新芝生物科技股份有限公司）ＩＩＤ，．

主要试剂：人皮肤恶性黑色素瘤细胞系Ａ酪氨酸、酪氨酸酶、左旋多巴（Ｌ３７５为本实验室保存，－、）二甲基亚砜（购自美国ｓ铜肽购自成都川抗派德生物医药科技有限公司，聚ｄｏａＤＭＳＯ）ｉｍａ公司，ｐｇ乳酸－乙醇酸（和聚乙烯醇（购自长春圣博玛生物材料有限公司，其他试剂均为购于商业ＰＬＧＡ）ＰＶＡ）渠道的分析纯试剂．１．２　方法

］／的方法，取９每孔分别添加８１．２．１　蘑菇酪氨酸酶活性测定　参考文献［９６孔板，０μＬ０．０６７ｍｏｌＬ　

，，／／磷酸缓冲液（溶于０．４Ｈ６．８）０μＬ２．５ｍｍＬ的酪氨酸溶液（０６７ｍｏｌＬ磷酸缓冲液，Ｈ６．８）　　　ｐｇｐ／／每孔的终体积为２含０４０μＬ不同浓度的铜肽溶液，４０μＬ９６ＵｍＬ蘑菇酪氨酸酶溶液．００μＬ，．５ｍｍＬ　ｇ

／底物，以及各种不同浓度的铜肽．未加铜肽的孔作为阴性对照．混匀后，在３１９．２ＵｍＬ酶，７℃保温于４以空白孔调０，每一实验重复３次．２ｈ，７５ｎｍ波长处比色，

按以下公式计算酶激活率：

（］／［酪氨酸酶激活率＝［Ｃ－Ｄ）Ａ－Ｂ）Ａ－Ｂ］－（×１００％．

（）１

其中，Ａ为未加铜肽的加酶混合液所测的吸光度，Ｂ为未加铜肽也未加酶的混合液所测的吸光度，Ｃ为

加铜肽样品和酶的混合液所测的吸光度，Ｄ为加铜肽但未加酶的混合液所测的吸光度．

再称取０．１．２．２　铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子的制备　称取５０ｍＬ水中，１ｇＰＬＧＡ溶于ｇ铜肽溶于５ｍ　

迅速抽取铜肽溶液和Ｐ用封口膜将注５ｍＬ二氯甲烷中，ＬＧＡ溶液于未加针头的一次性无菌注射器中，射器细口处封住，水浴加热至５然后放在振荡器上震荡摇匀５ｍ可得初乳．５℃，ｉｎ，

称取０．浸泡１ｈ，适当搅拌使其充分溶胀、分散．然后，逐步提高温５ｇＰＶＡ溶于１００ｍＬ水中，　度，并不停地搅拌，速度为６然后加入搅拌子，放在磁００００ｍＬＰＶＡ水溶液预热到５５℃，　ｇ～１ｇ．取３力搅拌器上．将装有初乳的无菌注射器装上细口针头，缓慢地将初乳注射到Ｐ待搅拌混ＶＡ水溶液中，、将其放入超声细胞破碎仪中．在功率２超声１暂停１超声６匀３ｍｉｎ后，００Ｗ、０ｓ０ｓ的条件下，０～７０次左右，即得到复乳．

在水浴４用磁力搅拌器在通风橱中匀速搅拌复乳１ｈ，使二氯甲烷挥发完全．将溶液０℃条件下，

９０　

辽宁师范大学学报（自然科学版）第４２卷

均匀分装于２个离心管中，取上清，得Ｐ５０００ｉｎ，ＬＧＡ微球初提液．将ＰＬＧＡ微球初提液均　ｇ离心５ｍ匀分装于离心管中，再１分别回收沉淀和上清．沉淀为包裹ＧＨＫ－Ｃ２００００ｍｉｎ，ｕ的ＰＬ－　ｇ高速离心１游离的铜肽在上清中．ＧＡ纳米粒子，

／得到１ｍ配制质１．２．３　铜肽包封率测定　称取１５ｍ５ｍＬ蒸馏水中，ｍＬ铜肽标准液，ｇ铜肽溶于１ｇ

／量浓度为０并与不同质量．２、０．４、０．６、０．８ｍｍＬ的铜肽溶液．然后取含有游离铜肽的离心上清液，ｇ浓度的铜肽溶液一起加入９放入酶标仪中，在５６孔板，８９ｎｍ测其吸光度．根据数据结果画出铜肽标准曲线，将离心上清液的吸光度带入曲线，求出游离铜肽的质量浓度，并按（１－游离铜肽的量／加入铜肽总量）×１００％的计算公式求出包封率．

用蒸馏水反复洗涤３次，然后加入１．２．４　纳米粒子的粒径测定与形态观察　纳米粒子高速离心后，

充分分散纳米粒子，取１１ｍＬ蒸馏水涡旋振荡，００μＬ测粒子平均直径．用于电镜观察的粒子样品用质量分数）磷钨酸负染２ｍ然后利用透射电镜观察粒子的形态．２％（ｉｎ，

待细胞生长至融合状态，３７５为本实验保存，１．２．５　细胞系及其培养　人皮肤恶性黑色素瘤细胞系Ａ

２

经０．质量分数）胰蛋白酶消化传代，接种于２用Ｒ培养瓶中，２５％（５ｃｍＰＭＩ１６４０培养液置于３７℃　

体积分数）每一次实验取自同一传代细胞，初始接种细ＣＯ５％（ＣＯ２培养箱，２饱和湿度环境进行培养．

５胞浓度为０．个／５×１０Ｌ左右．ｍ

５

，在９加入５个Ａ１．２．６　铜肽纳米粒子转染　转染前１ｄ６孔板内铺上０．５×１０３７５细胞，００μＬ无抗

，生素培养基培养１ｄ使其在转染时达到８分别加０％～９０％的融合．用无血清培养基冲洗细胞２遍后，

入０～２用无血清培养基补足４对照组加入新鲜培养液，轻轻００μＬ不同体积的铜肽纳米粒子，００μＬ，混匀，在３体积分数）７℃，５％（ＣＯ～６ｈ．２饱和湿度环境中保温５

吸去培养液，收获细胞，用血细胞计１．２．７　酪氨酸酶活性测定和黑素含量测定　转染１２、２４、４８ｈ后，／孔的量加入１％（数器进行细胞计数，重新将细胞铺入９体积分数）ＰＢＳ液洗３次，６孔板．按４５μＬ／孔的量加入０．／，震荡１溶解细胞，按１ｒｉｔｏｎＸ００溶液，０ｍｉｎ，００μＬ０１ｍｏｌＬ的Ｌ－ｏａ３７℃孵育Ｔ１ｄ－ｐ以空白孔调０，酶联免疫检测仪检测４实验重复４次．酪氨酸酶活性以（转６０ｍｉｎ，７５ｎｍ处吸光度值，／细胞数）／细胞数）／（染组Ａ空白对照组Ａ４７５４７５×１００来表示．实验重复４次．

转染１吸去培养液，收获细胞，用血细胞计数器进行细胞计数，重新２、２４、４８ｈ后，ＰＢＳ液洗３次，／孔１ｍ／，将细胞铺入９含１体积分数）于６６孔板．加入１００μＬｏｌＬＮａＯＨ溶液（０％（ＤＭＳＯ）５℃水浴　中保温１ｈ，完全溶解黑色素颗粒．以空白孔调０，酶联免疫检测仪检测４黑色素含７５ｎｍ处吸光度值，／（／细胞数）／细胞数）量以（转染组Ａ空白对照组Ａ４７５４７５×１００来表示．实验重复４次．

１．２．８　统计学方法　应用ＳＰＳＳ１４．０统计软件进行统计学处理．数据分析采用ｔ检验和方差分析，

Ｐ＜０．Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义，０１表示差异显著．

２　结果

１　铜肽对酪氨酸酶活性的影响２．

实验结果显示，铜肽对蘑菇酪氨酸酶有激活作用，与对照组相比具有显著差异．随铜肽质量浓度的／增加，酪氨酸酶的活性逐渐增强，但当铜肽的质量浓度大于０．继续增加铜肽的浓度，酶的１ｍｍＬ时，ｇ）活性不再增强（表１．

２．２　铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子的表征采用铜肽包封率测定方法，测得Ｐ通过激光粒度仪对ＬＧＡ纳米粒子中铜肽的包封率为４０．１２％．铜肽Ｐ其粒径大小为１平均直径为１呈狭ＬＧＡ纳米粒子的粒径测量结果显示，００～２００ｎｍ，４２．６ｎｍ，窄正态分布，说明制备的铜肽Ｐ纳米粒子为大小ＬＧＡ纳米粒子大小均一．１５００００倍透射电镜下观察，　）均一的圆球形，分散度较好（图３．

第１期赵春晖等：ＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞黑色素合成作用的研究　铜肽Ｐ９１　

表１　不同质量浓度铜肽作用下酪氨酸酶的激活率

ａｂｌｅ１　ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｒｏｓｉｎａｓｅｅｆｆｅｃｔｅｄｂｔｒｅａｔｍｅｎｔＴ　　　　　　ｙｙ　

ｗｉｔｈＧＨＫ－Ｃｕａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　　　　测试样品空白对照

（·ｍ质量浓度／ｍＬ－１）激活率／％ｇ

２１±０．２６１．

００１０．　０１０．　１０．　０１．　

＊

２２．７８±２．１１＊１１２．５７±３．５４＊１３３．２１±４．３２＊１３５．８７±４．２８

铜肽

图３　铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子的透射电镜观察

与空白对照组比较，０５，０１＊＊Ｐ＜０．＊Ｐ＜０．

Ｆｉ．３　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｉｍａｅｏｆ　　　ｇｐｙｇ　）ｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ（ｍａｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ×１５００００ＧＨＫ－Ｃ　　－Ｐｐｇ

３　铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的作用２．

与对照相比，不同质量浓度的铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞酪氨酸酶的活性均有不同程度的激活作用，黑素细胞中的黑素含量也呈不同程度的上调．而且，这种对酪氨酸酶的激活作用与黑素含）量上调作用随着铜肽Ｐ表２ＬＧＡ纳米粒子转染时间的延长而有不同程度的增强（．

表２　铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的作用

ｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｔｒｏｓｉｎａｓｅａｎｄｍｅｌａｎｏｅｎｅｓｉｓａｃｔｉｖｉｔｉｎｍｅｌａｎｏｃｔｅｓＴａｂｌｅ２　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＧＨＫ－Ｃ－Ｐ　　　　　　　　　　　ｐｙｇｙｙ　铜肽含量／·ｍ（Ｌ－１）ｇμ

２５　０５　００１　００２　

１２ｈ

）酪氨酸酶（ｎ＝４

）黑色素含量（ｎ＝４

４８ｈ

１２ｈ

２４ｈ

４８ｈ

２４ｈ

＊＊＊＊＊＊＊

１１２．３１±１５．８８７４．６２±１２．３５５２．４１±１７．５１２０．２１±２２．３７５２．１８±４２．１４１１２２１３３．３１±１５．１３＊　＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊１２５．７４±１３．８４１２１２３７６．４４±１７．６９２２．７５±２０．１１７１．５７±２３．４７６５．３４±３５．６０２７．６２±３８．６５＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊１３８．２５±１４．６２８７．９６±１５．２４５３．２１±３４．６８９３．２１±３４．１２９０．９５±３７．８２３３．１９±３１．２２１２１２３＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

１２１３３１５５．１７±１４．８１９５．９２±１８．１８７５．６２±２７．４１９６．８８±３２．５６１５．６６±４２．５８３５．１８±５２．３３

与空白对照组比较，空白对照组相应值设定为１００％；０５，０１＊Ｐ＜０．＊＊Ｐ＜０．

３　讨　论

酪氨酸酶活性的高低直接影响黑色素的合成．酪氨酸酶的活酪氨酸酶是黑色素合成中的关键酶，

性又与铜离子密切相关，铜离子不足将导致酪氨酸酶活性降低．铜肽中的铜离子是酪氨酸酶的激活剂．本研究发现铜肽ＰＬＧＡ纳米粒子对体外培养的正常黑素细胞黑素合成具有明显的增强作用．铜肽Ｐ其中，是铜肽的载ＬＧＡ纳米粒子是ＰＬＧＡ－ＶＡ双层微球包载水溶性的铜肽，ＰＬＧＡ作为内核，Ｐ体，而另一种生物相容性较好的聚合物Ｐ改变两层的厚度等条ＶＡ作为外层．通过调节两者的比例，件，可以达到控制铜肽释放的效果．关于纳米粒子的降解特征、载药量、释药速率等还需要进一步研究．另外，铜肽Ｐ如何刺激表皮黑素细胞的黑素合成有待进一步的ＬＧＡ纳米粒子通过哪些信号通路、

［０］１］１１

深入研究．目前报道的酪氨酸激活剂有８十二烷基磺酸钠［等，其中，８－甲氧补骨脂素、－甲氧补骨脂

素结合长波紫外线照射是临床常用的治疗白癜风和银屑病的方法．本研究为人黑色素异常而诱发的色素减退或色素脱失性皮肤病，如黄褐斑、白癜风、银屑病等的治疗提供了新的候选药物．

９２　

参考文献：

辽宁师范大学学报（自然科学版）第４２卷

［］，，（）：［］ＩＣＫＡＲＴＬ．ＴｈｅｈｕｍａｎｔｒｉｉｄｅＧＨＫａｎｄｔｉｓｓｕｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎＪ．ＪＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉＰｏｌｍＥｄ２００８，１９８６９８８．９９１ｅｔ　　　　　　　　　　－－　Ｐｇｙｐｐ［］ｌｕｉｏｓｏｍｅｓａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｃａｌｄｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｉｎｍｉｃｅｂｒｏｍｏｔｉｎｃｅｌｌｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｎ２Ｘ，ＬＩＵＢ，ＸＵ　Ｑ，ｅｔａｌ．ＧＨＫ－Ｃ－－　　　　　　　　　　ＷＡＮＧ　　　ｐｇｙｐｇｐ　　　

［］（）：２ｉｏｅｎｅｓｉｓＪ．ＷｏｕｎｄＲｅａｉｒＲｅｅｎ，２０１７，２５２７０７８．２－　　ｇｇｐｇ

［］［］，ｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｔｅｒｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ６３ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｂｋｅｒａｔｉｎｏｃｔｅｓＪ．Ａｒｃｈ３Ｙ　Ａ，ＣＨＯＩＨ　Ｒ，ＮＡＪＩｅｔａｌ．Ｃｏｅｒ　　　　　－ＧＨＫ　ＫＡＮＧ　　　　　ｇｐｐｙｙｙｐｐ　　

，３０６．ＤｅｒｍａｔｏｌＲｅｓ２００９，３０１：３０１－　

［］，［］，ｆ６ｒｅｅＧＨＫｉｎｓｋｉｎＪ．ＪＰｅｔＳｃｉ２０１２，１８：６８５９０．４ＩＨ　Ｒ，ＫＡＮＧＹ　Ａ，ＲＹＯＯＳＪｅｔａｌ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｃｏｖｅｒｉｎｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｅｒ－－　　　　　　　　ＣＨＯ　　　　　　　ｐｐｐｇ　［］ｂａｓｅｄｎａｎｏａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓｓｔｅｍｓ５ＡＨ　Ｈ，ＴＨＯＭＡＬＡ，ＤＥＳＵ　Ｈ　Ｒ，ｅｔａｌ．ＣｏｎｃｅｔｓａｎｄｒａｃｔｉｃｅｓｕｓｅｄｔｏｄｅｖｅｌｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＰＬＧＡ－　　　Ｓ　　　　　　　　　ｐｙｐｐｐ　

［］，７６５．Ｊ．ＩｎｔＪＮａｎｏｍｅｄ２０１３，８：７４７－　　

，：］（）［］贾玉龙，陈清西．酪氨酸酶抑制剂的应用进展［厦门大学学报（自然科学版）７２７Ｊ．０１６，５５５６０６９．６－　胡泳华，

，：］［］庄江兴，刘凤娇，等．厦门大学学报（自然科学版）２Ｊ．４００９，４８（２）７－氨基苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用机理研究［　邱凌，

０２０５．３３－［］，［］８ＥＥＳＹ，ＢＥＡＫ　Ｎ，ＮＡＭ　ＴＧ．ＮａｔｕｒａｌｓｅｍｉｓｎｔｈｅｔｉｃａｎｄｓｎｔｈｅｔｉｃｔｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＪ．ＪＥｎｚｍｅＩｎｈｉｂＭｅｄＣｈｅｍ，２０１６，３１　Ｌ　　　　　　　　　　　ｙｙｙｙ

：（）３．１１１－［］ｅｕｅｎｃｅｏｌｉｏｅｔｉｄｅｓｗｉｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｃｔｉｖｉｔａａｉｎｓｔｍｕｓｈｒｏｏｍａｎｄｈｕｍａｎｔｒｏｓｉｓ９ＢＥＩＤＡ　Ａ，ＺＨＡＯＬ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．Ｓｈｏｒｔ　　　　　　　－－　Ｕ　　　　ｑｇｐｐｙｙｇｙ　　

［］，ｎ２ａｓｅＪ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ２００９，１２９：２２４２２４９．－　　

：［］ｅｔｈｏｘｓｏｒａｌｅｎｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ１０ＥＩＴＣ，ＶＩＲＡＤＯＲＶ，ＹＡＳＵＭＯＴＯ　Ｋ，ｅｔａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｂｌａｓｔｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｂ８　－ｍ　Ｌ　　　　　　　　ｙｐｐｇｙ　

，，［］ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｔｈｅｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｓｉｎａｌａｔｈｗａａｎｄｒｏｔｅａｓｏｍｅｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｒａｄａｔｉｏｎＪ．ｏｆｍｉｃｒｏｈｔｈａｌｍｉａ－　　　　　　　　　　　ｐｐｇｐｙｐｇｐ，１３４９．ＪＩｎｖｅｓＤｅｒｍａｔｏｌ２００２，１１９：１３４１－　　

［］ＩＬＡＢＥＲＴ　Ｍ，ＭＯＲＴＥＡ，ＧＡＲＣＩＡ－ＣＡＲＭＯＮＡＦ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｏｆｔ１１ＥＲＥＺ　　　　　　　　　－Ｇ－　Ｐｙｙ　

［］，（）：ｒ３ｏｓｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂＳＤＳＪ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ２００４，１６６２６５７０．３－　　　ｙ　

Ｓｔｕｄｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｌａｎｏｅｎｅｓｉｓｉｎｍｅｌａｎｏｃｔｅｉｎｄｕｃｅｄｂ　　　　　　　　ｙｇｙｙ　

ＧＨＫ－ＣＰｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ－　ｐ

ＨＡＯ　ｈｕｎｈｕｉ，ＨＡＮＧ　ｈｕｘｉｎＺＣＣ　Ｚ，（ｉａｏｎｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏａｎｄＤｒｕＤｉｓｃｏｖｅｒＬ　　　ｇｙｙｇｙｇｙ　　　　　，，）ＣｏｌｌｅｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＬｉａｏｎｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＤａｌｉａｎ１１６０８１，Ｃｈｉｎａ　　　　　ｇｇｙ　

：，ｂｓｔｒａｃｔＧｌｃｌｉｓｔｉｄｌｉｎｅ（ＧＨＫ）ｕｈａｓｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｌｏｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｏｌｌａｃＡｈｌｓＣ　　　　　　－－－－ｙｙｙｇｙｐｙｙ

ｔｃＣＣｌｃｉｄｅｏｏｌｉｄｅ（ＰＬＧＡ）ｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄａｓｃａｒｒｉｅｒｆｏｒｅｎｃａｓｕｌａｔｉｎＧＨＫ－ｕｔｏｒｅａｒｅＧＨＫ－ｕ　　　　　　　　　－－ｇ－ｐｇｐｐｙ　

ＰＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｒｏｓｉｎａｓｅａｎｄｍｅｌａｎｏｅｎｅｓｉｓｉｎｍｅｌａｎｏｃｔｅｗｅｒｅａｎａｌｚｅｄ．　　　　　　　　　　　　ｐｙｇｙｙＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＧＨＫ－Ｃｕｃｏｕｌｄａｃｔｉｖａｔｅｍｕｓｈｒｏｏｍｔｒｏｓｉｎａｓｅ．Ｔｈｅｅｎｔｒａｍｅｎｔｅｆｆｉｃｉｅｎｃｏｆ　　　　　　　　　　ｙｐｙ　ＧＨＫ－ＣＰｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｗａｓ４０．１２％，ａｎｄａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｗａｓ１００～２００ｎｍ．Ｒｏｕｎｄｗｉｔｈｕｎｉｆｏｒｍ－　　　　　　　　　ｐｐｓｉｚｅａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｅ．ＧＨＫ－ＣＰｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ　　　　　　　－　ｐｐｐ，ｕｉｎｔｏｍｅｌａｎｏｃｔｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｒｏｓｉｎａｓｅａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｍｅｌａｎｏｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｄｅｌｉｖｅｒｅｄＧＨＫ－Ｃ　　　　　　　　－ｙｙｙ　ｎｅｓｉｓ．ＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｒｏｖｉｄｅｔｈｅｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔＧＨＫ－ｕＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｕｔｉｌｉｚｅｄａｓａｅＣＰ　　　　　　　　　　　　－ｐｐｇ

ｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｈｏｍｅｌａｎｏｓｉｓｏｒｄｅｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｄｉｓｏｒｄｅｒ．　　　　　ｙｐｐｇ

：；；；Ｋｅｗｏｒｄｓｌｃｌｉｓｔｉｄｌｉｎｅ（ＧＨＫ）ＬＧＡｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｍｅｌａｎｏｃｔｅｍｅｌａｎｏｅｎｅｓｉｓｈｌｓＰ　－－ｇｙｙｙｐｙｇｙｙ